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1、实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法指导老师：程 燕,实验目的,1、学习实验动物不同部位的取无菌采血方法；2、学习动物血清、红细胞的制备；3、观察兔、豚鼠的免疫器官。,实验原理,免疫系统由免疫器官、免疫组织、免疫细胞和免疫分子组成。免疫细胞 1.固有免疫的组成细胞：吞噬细胞、淋巴器官、树突状细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；2.适应性免疫应答细胞：T细胞、B细胞免疫分子 1.膜型分子：TCR、BCR、CD分子、粘附分子、MHC分子、细胞因子受体。2.分泌型分子：免疫球蛋白、补体、细胞因子。,实验原理,血液是一种结缔组织（细胞间质）。血液系统是各种重要的免
2、疫细胞、免疫分子的载体，也是各种免疫事件发生的场所。组成：1、血浆 血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原）脂蛋白、无机盐、氧等成分 激素、酶、抗体 细胞代谢产物等。2、血细胞 红血球、白血球（有粒白细胞：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞和无粒白细胞：单核细胞和淋巴细胞)血小板,实验原理,实验研究中，要采集实验动物的血液进行检查或分析，故必须掌握血液的正确采集、分离和保存的操作技术。采血方法的选择，主要决定于实验的目的所需血量以及动物种类。用血量较少可刺破组织取毛细血管的血 当需血量较多时可作静脉采血（原则：静脉采血时，若需反复多次，应自远离心脏端开始，以免发生栓塞而影响整条静脉),实验原
3、理,现将采用血方法按动物和部位分别加以介绍。小鼠和大鼠采血方法：割尾采血法、尾静脉穿刺采血、眼眶后静脉丛采血、摘眼球法、断头采血、颈（股）动静脉采血豚鼠采血法：耳缘剪口采血、心脏采血、股动脉采血、背中足静脉取血 兔采血法：耳静脉采血、耳中央动脉采血、心脏取血、后肢胫部皮下静脉取血、股动静脉、颈动静脉取血、鸡采血法：翼根静脉采血、心脏采血、颈静脉采血,实验原理,家兔采血方法（1）耳缘静脉采血：家兔固定，将耳缘静脉皮肤上的毛拔去或剪去，75%酒精消毒，用左手食指和中指夹住静脉近心端，以使其血管怒张拇指和小指夹住耳缘部分，以左手无名指和小指放在耳下作垫，待静脉充盈后，右手持注射器使针头由静脉末端刺入
4、，顺血管方向向心端刺约1-1.5cm，放松左手拇指和食指对血管的压迫，右手缓慢抽吸注射器，若注射阻力较大，说明针头没有刺入静脉，应调整针头或重新穿刺；也可以刀片在血管上切一小口，让血自然流出，滴入盛器内，采血完毕，用干棉球按压止血。,（2）兔心脏穿刺取血：家兔背位固定，在左胸第24肋间剪毛一块，用75%酒精和碘伏消毒。然后用510ml注射器，在胸骨左缘3-4肋间心尖搏动最明显处作垂直穿刺。注意事项有：动作宜迅速，以缩短在心脏内的留针时间和防止血液凝固；如针头已进入心脏但抽不出血时，应将针头稍微后退一点。在胸腔内针头不应左右摆动以防止伤及心，肺、,实验原理,豚鼠采血方法（1）背中足静脉取血 固定
5、动物，将动物脚背面用酒精消毒，找出背中足静脉后，以左手的拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手拿的注射针刺入静脉。采血后，用纱布或脱脂棉压迫止血。反复采血时，两后肢交替使用。（2）心脏采血 通常在胸骨左缘的正中，选心跳最强的部位作穿刺。针头宜稍细长些，以免发生手术后穿刺孔出血，其操作手法详见兔心脏采血。,实验动物的采血量,血清的制备,血清的制备：不加抗凝剂无菌静脉采血2ml，37自然凝固，待血清开始出现后，放冰箱内12小时或24小时，离心分离血清（3000rpm，5-10min），得到的上清液即为血清，小心将上清吸出（注意切勿吸出细胞成分）。血浆的制备：需加抗凝剂（抗凝剂：血液=1：9）无菌静脉采血2
6、ml（注射器用抗凝剂润洗），将血液加入到有抗凝剂的离心管中颠倒混匀，离心（3000rpm，5-10min）后所得的上清液即为血浆。注意：血清的保存可以在每50ml血清中加1硫柳汞水溶液1ml防腐。,红细胞及悬液制备,标准红细胞的制备：取全血1ml，加等渗盐水23ml，充分摇匀离心沉淀，弃去上清液，然后再加生理盐水23ml 按上述方法洗涤，共三次，离心去上清，余下的为压积红细胞。红细胞悬液的制备：2红细胞悬液：压积红细胞2滴+新鲜等渗盐水4ml 5红细胞悬液：压积红细胞5滴+新鲜等渗盐水4ml 10红细胞悬液：压积红细胞5滴+新鲜等渗盐水2ml注意：标准红细胞盐水悬液临用前制备，最多存放3天，用
7、柠檬酸葡萄糖溶液（ACD）溶液保存最长可保存1周,实验器材,实验动物：豚鼠、兔实验试剂：血液抗凝剂（1:500u肝素钠注射液）生理盐水实验器材：5ml注射器、一次性离心管（5、10、15ml规格）、普通吸管、尖吸管、1ml刻度吸管 75%酒精棉球 水平离心机,实验步骤,1.用75酒精棉球消毒采血部位皮肤2.用5ml注射器分别抽取豚鼠或兔静脉血2ml豚鼠采血法：背中足静脉取血 心脏采血、兔采血法：耳缘静脉采血 心脏采血 3.制备血清、红细胞（如上述流程）,注意事项：,1、采血部位需要进行消毒2、采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥；3、注意血清与血浆制备的区别：抗凝剂的使用4、不同规格离心管的使用,实验作业,1、血清、血浆的组分的区别？2、血清、血浆制备方法及操作的区别？,
