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1、实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应,1.酶联免疫吸附试验（ELISA),免疫标记技术,定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC(异硫氰酸荧光素)，PE(藻红蛋白)免疫酶测定法：HRP，AP,Isotype of antibody:,Immunize Rabbit,Mouse IgG1,Rabbit anti-mouse IgG1Secondary Ab,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶标记
2、的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法（Indirect ELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（Sandwich
3、ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),3.原理（以间接性ELISA为例）：,显色,实验内容：间接法测定溶血素 定性检测,实验材料,脱纤维绵羊红细胞 抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG 二抗包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween 20的0.01M pH7.4 PBS底物缓冲液
4、：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30%H2O2 40L酶标板，酶标仪,实验方法,1.抗原的处理：,脱纤维绵羊血,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,取2mL压积红细胞,加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞,用包被缓冲液稀释成1：400备用,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,
5、阳性,待测,4.加二抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标二抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,预期结果,阳性：显色为黄色阴性：无色,1 2 3 4,阴性,阴性,阳性,阳性,注意事项,洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。,2.补体结合反应（Complement fixation Test,CFT）,概念：,补体结合反应：是指在补体的参与下，以
6、绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。,补反中包括两个系统五种成分：待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,待测系统抗原+未知血清,补体,1,2,Step 1 抗原抗体复合物的形成,Step 2补体的结合和耗竭,指示系统SRBC+抗SRBC抗体,Step 3SRBC的裂解,1,2,1：No Ab；2：Ab,Ag,Y,Ab阳性,No Ab阴性,Ag,Ag,Ag,抗原：伤寒菌裂解产物待测血清：56，30min补体：豚鼠血清2%绵羊红细胞溶血素,材料：,方法：,1,2,3,4,5,
7、试验管,血清对照管,抗原对照管,补体对照管,SRBC对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀，37，水浴15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,摇匀，37，水浴15min,（1份/2人）,预期结果：,1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,溶血,不溶血,2.,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。各种试剂的吸管不可混用。,注意事项：,
