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1、实验五 食品中大肠菌群的计数,参考 GB47893-2010,广东科贸职业学院,2,1、了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。2、练习并掌握大肠菌群的检验方法。,一、目的,广东科贸职业学院,3,二、原理,1、大肠菌群大肠菌群系指一群在37、24小时能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。,广东科贸职业学院,4,主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的亚属细菌组成。典型大肠杆菌的IMViC与硫化氢试验结果为+-。,广东科贸职业学院,5,该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
2、它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每1g（或mL）检样内大肠菌群最可能数MPN（themostprobablenumber-简称MPN）表示,2、测定的意义,广东科贸职业学院,6,三、材料,1、食品样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。2、阳性对照菌大肠杆菌,广东科贸职业学院,7,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。,3、仪器设备,广东科贸职业学院,8,月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌
3、绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH)、1mol/L 盐酸（HCI)。,4、培养基和试剂,广东科贸职业学院,9,第一法 大肠菌群MPN计数法。第二法 大肠菌群平板计数法。,四、检验方法,广东科贸职业学院,10,试验流程,广东科贸职业学院,11,1、样品的稀释（1）固体和半固体样品称取25g 样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000r/min-10000r/min 均质1 min-2 min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2
4、 min，制成1:10 的样品匀液。,第一法 大肠菌群MPN计数法,广东科贸职业学院,12,（2）液体样品以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。（3）样品匀液的pH 值应在 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或1 mol/L 盐酸（HCI）调节。,广东科贸职业学院,13,广东科贸职业学院,14,（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1
5、 支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。,广东科贸职业学院,15,（5）、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。,广东科贸职业学院,16,每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）,361 培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h2h。,2、初发酵试验,广
6、东科贸职业学院,17,记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。,广东科贸职业学院,18,用接种环从所有48h2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，361 培养48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,3、复发酵试验,广东科贸职业学院,19,根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录B)，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。,4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告,广东科贸职业学院,20,第二
7、法 大肠菌群平板计数法,广东科贸职业学院,21,大肠杆菌0157显色培养基上的菌落,广东科贸职业学院,22,在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上,广东科贸职业学院,23,大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征,典型菌落为红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 2-3mm 或更大。,广东科贸职业学院,24,大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征,典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 0.5mm 或更大。,广东科贸职业学院,25,大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征,广东科贸职业学院,26,广东科贸职业学院,27,试验流程,广东科贸职业学院,28,1、样品的稀释,按第一法中
8、的稀释方法进行。,广东科贸职业学院,29,（1）选取2个3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。（2）及时将15 mL-20mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36l 培养18h-24h。,2、平板计数,广东科贸职业学院,30,（3）平板菌落数的选择选取菌落数在15-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直
9、径为0.5 mm 或更大。,2、平板计数,广东科贸职业学院,31,（4）、证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，361 培养24h-48h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。,2、平板计数,广东科贸职业学院,32,（5）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。,2、平板计数,广东科贸职业学院,33,例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取 其中10个接种BGLB肉汤管，证实
10、有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。,广东科贸职业学院,34,国标4789.3的08版与03版主要不同,1、名称更改 以大肠菌群计数代替原来的大肠菌群测定。2、增加了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法。3、大肠菌群的MPN法以乳糖为主改为以月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤为主的要培养基的MPN法。4、大肠菌群的MPN法中原“报告每100 ml（或g）大肠菌群的MPN值”改为“报告每1 ml（或1g）大肠菌群的MPN值”。,广东科贸职业学院,35,比较区别GB/T4789.38-2008大肠杆菌的计数,广东科贸职业学院,36,
11、03版流程,广东科贸职业学院,37,广东科贸职业学院,38,一、步骤,取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同，做成1:10的均匀稀释液为检样。,广东科贸职业学院,39,同一稀释度在做菌落总数测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。,广东科贸职业学院,40,1、乳糖发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。,广东科贸职业学院,41,接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。,广东科贸
12、职业学院,42,置361温箱培养242小时，如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。,广东科贸职业学院,43,2、分离培养 将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置361温箱内，培养1824小时后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。,广东科贸职业学院,44,可疑菌落特点：具有金属光泽的深紫黑色菌落；不带或略带金属光泽的菌落；中心色较深的淡紫黑色菌落。,广东科贸职业学院,45,3、证实试验 在上述平板上挑取可疑大肠菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361温箱培养242小时,观察产气情况，凡
13、乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。,广东科贸职业学院,46,4、报告 根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。,广东科贸职业学院,47,二、结果根据证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表(见附录)报告每100ml(克)大肠菌群的最可能数。,广东科贸职业学院,48,三、注意事项,1、第一步乳糖胆盐发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，初发酵阳性管，经过后两步，有可能成为阴性。只做一步，会有相当多的合格样品作为不合格处理，应注意。,广东科贸职业学院,49,2、胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长，有利于大肠杆菌的生长繁殖。
14、,广东科贸职业学院,50,3、接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。,广东科贸职业学院,51,4、大肠菌群菌落在EMB琼脂上大多呈紫黑色有金属光泽或无金属光泽。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。一般平板上有较多的大肠杆菌典型菌落，且革兰氏染色为阴性，可做出判定。,广东科贸职业学院,52,5、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。,广东科贸职业学院,53,6、MPN检索表是采用三个稀释度九管法，较理想的结果是最低3管为阳性，最高3管为阴性。如无法估测样品中的
15、菌数时，应做一定范围的稀释度。,广东科贸职业学院,54,7、MPN检索表只提供了3个稀释度，若改用其它浓度时，表内数字应相应增加或减少。,广东科贸职业学院,55,酱油（GB/T2717-2003）细菌菌落总数：30000cfu/ml大肠菌群：30MPN/100ml肠道致病菌：不得检出,广东科贸职业学院,56,全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）特级 一级 二级细菌菌落总数：20000 30000 50000（cfu/ml）大肠菌群 40 90 90（MPN/100g）肠道致病菌：不得检出 不得检出 不得检出,广东科贸职业学院,57,巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：30000cfu/ml大肠菌群：90MPN/100ml肠道致病菌：不得检出,广东科贸职业学院,58,生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数cfu/ml：100总大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出耐热大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出大肠埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出,广东科贸职业学院,59,瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准(GB 17324-2003)细菌菌落总数cfu/ml：20大肠菌群MPN/100ml：3致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出,广东科贸职业学院,60,
