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1、1.微生物大小测定2.微生物数量测定3.大肠杆菌生长曲线的测定,实验五,学习使用镜台测微尺和目镜测微尺；在显微镜下测定微生物大小。,实验(一)微生物大小的测定,一、目的要求,二、实验原理,镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是l mm等分为100格，每格长0.01 mm(即10 um)，用于校正目镜测微尺每格的相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度。目镜测微尺每小格所代表的实际长度不一样，需将其放在接目镜中的隔板上，测量前，必须先用镜台测微尺进行校正。,目镜测微尺,镜台测微尺,1.利用镜台测微尺测定目镜测微尺的每格绝对值2.目镜测微尺每格长度（
2、um）两重合线间镜台测微尺格数10/两重合线间目镜测微尺格数3.利用目镜测微尺测定微生物大小,三、实验器材,1、菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2、器材：显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺,三、实验步骤,1、目镜测微尺的校正 镜台测微尺有刻度的一面朝上，置显微镜载物台上，先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。先10 x，后40 x，分别计算10 x,40 x下目镜测微尺的校正值。2、细胞大小的测
3、量 酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。,三、实验结果,1.计算出目镜测微尺校正结果（物10和40）2.酵母菌大小测定酵母菌大小测定,选择5-8个酵母菌，测定其40大小范围。,四、思考题 p51 2(2),1、明确血细胞计数板计数的原理。2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。,实验(二)微生物数量的测定,一、目的要求,显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种方法。用于细胞总数的测定显微镜直接计数法的优点是直观、快速。缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和
4、。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色，微室培养等方法来达到只计数活菌体的目的。,二、实验原理,血细胞计数板由两条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为八个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室是由一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；共计400个小方格。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，以及大方格中的总菌数，再换算成1 ml菌液中的总菌数。,个计数室mm包含个中方格,个中方格个小方格,三、实验器材,1、菌种：酿酒酵母、大肠杆菌 2、器材：显微镜、血球计数板,三、实验步骤
5、,1、在10和40下找到计数室。2、盖上盖玻片将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。3、静置5 min，先用低倍镜将计数室移至视野中央。4、在高倍下(40X)计数：对两个计数室记数，方法：每个计数室选5个中格(4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数，求得每个中方格的平均值，再乘上25即为大方格中的总菌数，最后换算成1ml菌液中的总菌数。对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数。5、最后的结果是两个计数室所记菌数的平均值,三、实验结果,1、统计每个计数室（五个中格）的细胞数量,四、思考题 p56 2(1),2、计算每m
6、l酵母菌悬液的酵母菌数量。稀释倍数为1,通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线。了解光电比浊计数法的原理。学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。,实验(三)大肠杆菌生长曲线的测定,一、实验目的,生长曲线 将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以菌数为纵坐标作图，得到一条反映单细胞微生物在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,二、实验原理,一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期,稀释平板计数法,对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。优点：活菌计数方法，对设备要求不高。缺点：操作复杂。,显微镜直接计数法,使用血
7、球计数板在显微镜下直接计数。优点：操作简便，计数直观。缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。,测定细胞数量的常用方法,光电比浊法,光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多。,优点：简便快速，适合于自动控制。缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。,菌种 培养不同时段的大肠杆菌。仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。,三、实验器材,开电源，仪器预热20 min，将波长调至600 nm处。打开样品室，将档光体插入比色皿架，将其推或拉入光路。盖好样品室盖，在T MODE下，按0%
8、T键调零透射比。取出档光体，按100%T/OA键调100%透射比。,四、实验步骤,1.样品测试前的调试,2.样品测定,将参比溶液（未接种的LB液体培养基）以及被测溶液倒入比色皿中。打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。将参比溶液推入光路，按100%T/OA键调满度。按MODE，将测试方式调至吸光度方式（A）。此时,显示器显示“0.000”。将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样品的吸光值。,在600 nm波长下，用未接种的LB液体培养基作空白对照，分别对培养了0、4、8、12、16和20 h的大肠杆菌培养液，进行光电比浊测定。对于高浓度的大肠杆菌培养液,要用未接种的LB培养基进行稀释，使其吸光值不超过1。,比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。,四、实验结果,记录不同大肠杆菌培养液的OD600值，并绘制大肠杆菌的生长曲线。,五、思考题 p88 2(1),
