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1、第六节 染菌的防治,什么是染菌？发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖,一、染菌的影响,发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量,（一）染菌对发酵的影响,生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果,1、发酵染菌对不同品种的影响,放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。青霉素发酵染菌，
2、绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。,不同菌,不同产品,链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。,不同产品,疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的
3、损失也越大。,不同产品,2、污染不同种类和性质的微生物的影响,（1）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。,（2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。,3、不同时间染菌对发酵的影响,污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来
4、，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。,（1）种子培养期染菌,由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。,（2）发酵前期染菌,发酵前期最易染菌，且危害最大。原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消
5、耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。,（3）发酵中期染菌,发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。,（4）发酵后期染菌,发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。,（二）发酵
6、染菌对提炼和产品质量的影响,1、发酵染菌对过滤的影响,染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。,污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率。,2、发酵染菌对提炼的影响,染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，
7、影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。,二、染菌的原因,（一）发酵染菌率计算基准总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方法。总染菌率%=,（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的，但在实际生产中发酵染菌率仍比较高，可以说
8、产生这种现象大多数是由于工作中“明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理”所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告终。现将我们收集到的国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：,日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目 百分率%种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶 0.48夹套穿孔 12.36盘管穿孔 5.89接种管穿孔 0.39阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏 1.54其它设备渗漏 10.13操作
9、原因 10.15 原因不明 24.94,上海第三制药厂染菌原因分析 项目 百分率%种子带菌 14.15盘管穿孔 14.20阀门渗漏 23.30空气系统有菌 10.0管理不善 25.80其它 7.49原因不明 5.78,管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08经分析有下表所列原因：项目 百分率%进罐前未做设备严密度检查 25.8接种违反操作规程 25.8检修质量缺乏验收制度 19.35操作不熟练 19.35配料违反工艺规程 6.45调度不当 3.25,第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析 项目 百分率%外界带入杂菌（取样、补料）8.20设备穿孔 7.60空气系统有菌 26.00停电罐压跌零 1.6
10、0接种 11.00蒸汽压力不足或蒸汽量不足 0.60管理问题 7.80 操作违反规程 1.60种子带菌 0.60原因不明 35.00,造成染菌的主要原因总结,1、设备渗漏,设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占33.85，上海三厂的分析这类染菌为37.5。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重要的。,2、空气带菌,从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为19.96和 26%。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到
11、理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。,3、种子带菌,种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。,4、灭菌不彻底,灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间产生过多泡沫蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发现23个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同而发生明显变化。,原材料
12、储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料杂菌的数量发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要的。,5、技术管理不善,技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理,三、无菌状况的检测,1、环境无菌的检查尘埃粒子检测无菌平板检测,2、种子及发酵液无菌状况检测,酚红肉汤培养基检测平板划线显微镜观察,四、染菌情况分析,染菌的原因有多种，对于实际情况如何分析呢？,1、单罐染菌不是系统问题，而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效,2、多罐染菌系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过
13、滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底,3、前期染菌种子带菌、培养基灭菌不彻底,4、中后期染菌补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题,五、染菌的防止,1、防止种子带菌,制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶、母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。,无菌室要求,在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地，开启超净台的通风，接种时必须在超净台上操
14、作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。,2、防止设备渗漏,发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现。,试漏方法可采
15、用水压试漏法。即被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求压力，关闭进出水，看压力有否下降。压力下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只要酚酞能变红处即为渗漏处。阀门渗漏可以用集气桶来试漏。方法是先在集气桶中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空气，使罐压上升到要求压力，一般一公斤以上。由于集气桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀门漏气。,3、防止培养基灭菌不彻底,培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌分批灭菌 1210C，30分钟连续灭菌 罐温1251300C，3045分钟,蒸汽下进上出,连续灭菌设备流程,连 消
16、 塔,培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。,防止方法：缓慢开启蒸汽阀门，或加入少量消泡剂。灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角”。这些死角蒸汽不能有效达到，常会窝藏耐热芽孢杆菌，所以设备安装要注意不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。,4、防止空气引起的染菌,
17、空气过滤除菌设备流程,空压机,储罐,二级冷却,加热器,空气过滤,粗过滤,空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。棉花-活性炭过滤器长期使用后，棉花和活性炭的体积被压缩而松动，如果上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置，造成过滤器失效。过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能，灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。,超细纤维纸作过滤介质，灭菌时必须将管道中冷凝水放干净，以免介质受潮失效。在生产实践中，空气管道大多与其它物料管道相接，要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管
18、道污染过滤器，导致过滤介质失效。,5、发酵染菌后的措施,染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。,四、染噬菌体的防治,（一）染噬菌体对发酵的影响,发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会反复连续感染，使生
19、产无法进行，甚至使种子全部丧失。,染噬菌体表现为：1、镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则，严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自溶。2、发酵pH值逐渐上升，48小时之内可达8.0以上，不再下降。3、发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。4、生产量甚少或增长缓慢或停止有无染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验,（二）产生噬菌体的原因,通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害，经过12年以后，主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播，以及人们的走动、车辆的往来也
20、携带着噬菌体到处传播，使噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐,（三）染噬菌体的检测在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加入2030培养好的种子液，再加入怀疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基表面，培养过夜，观察有无透明圈出现。,（三）噬菌体的防治,1、必须建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面 3、种子和发酵工段
21、的操作人员要严格执行无菌操作规程，认真地进行种子保管，不使用本身带有噬菌体的菌种。感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间,4、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排放。5、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种。6、发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。,小 结,染菌对发酵的危害：干扰生产菌的正常代谢，降低产量改变pH，降解某些产物污染不同的微生物，不同阶段染菌危害,染菌对提炼的危害：过滤困难而大幅度降低过滤收率有机溶剂萃取时发生乳化,染菌原因,设备渗漏空气带菌种子带菌灭菌不彻底技术管理不善,染菌后的措施,染菌防治,发酵液必须灭菌后才可放下水道寻找染菌的原因染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒,产生噬菌体的原因活菌体随意排放，造成噬菌体的感染源,噬菌体的防治,危害：造成断种，无法生产,建立工厂环境清洁卫生制度感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到70800C杀死噬菌体，才可排放。环境用漂白粉消毒选育抗噬菌体的菌种,思考题7.23 染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？7.24 有哪些原因会引起染菌？7.25 染菌以后应采取什么措施？7.26 为什么会感染噬菌体？感染了噬菌体后应采取哪些措施？,
