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1、微生物的分离培养和接种技术,河南师范大学环境科学与工程实验教学中心,实验目的、要求,（1）学习并掌握细菌、放线菌、霉菌和酵母菌等四大类微生物的稀释分离、划线分离等技术。（2）学习从样品中分离、纯化出所需菌株。（3）了解四大类微生物的培养条件和培养时间。（4）学习平板菌落计数法（下次实验）。以细菌为例,实验原理,纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。纯种（纯培养）：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。土壤是微生物的
2、大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有这一种微生物的纯培养。稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见实验指导书P67表格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37 温度下培养1-2天。平板菌落计数活菌计数,0.9,0.1,0.9ml,分离纯化基本流程,实验仪器、材料,实验材料 菌源:土样10g;培养基 牛肉膏蛋白胨培养基;实验仪器与用具1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯2）1000ul及100ul移液枪、10
3、00ul及100ul枪头、无菌1.5ml的离心管、离心管架3）无菌平皿、涂布棒、接种环实验试剂:无菌水;,实验内容,1、采土样:选择肥沃土壤,去表层土,挖520cm深度的土壤数10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室。2、制备土壤稀释液：称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水的三角瓶中，置摇床振荡20min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。用100ul移液枪从中吸取100ul土壤悬液，注入事先分装有900ul无菌水的离心管中，吹吸3次，振荡均匀（10-3）。然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5的土壤菌悬液。,3、分离1）涂布法 用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓
4、度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板（重复）。2）倾注法 用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的空白无菌平皿中，然后在各平皿中加入已经融化并冷却到45-50的牛肉膏蛋白胨培养基（已灭菌）12-15ml，将培养皿在超净工作台面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的培养基混合均匀，直至培养基凝固。注意：无菌操作；用枪头吸取菌悬液时注意“吹打数次”确保混匀。4、培养待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于370C温箱中培养24h；,5、菌落计数含
5、菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可据平板上菌落的数目推算出每克含菌样品中所含的活菌总数（菌落形成数目）。每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU（同一稀释度平板上菌落平均数 10稀释倍数）/含菌样品克数,菌落计数规则：选择平均菌落数在30300间的平板1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：1）若0.5比值2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告。2）若2比值或比值 0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。3、若所有
6、稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；所有菌落数均不在30300间以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数,6、挑菌划线分离挑取单个菌落（细菌菌落），分别在平板上做分区和连续划线。370C培养48h检查菌落是否单纯。划线方法：详见实验指导书P72、P237 无菌操作（近火焰处操作）：接种环灼烧灭菌、冷却 左手取涂布分离培养后平板 右手用接种环挑取涂布分离培养的平板中的目的单菌落 用已经粘有菌体的接种环 于另一新的空白平板中划线分区划线法：灼烧、冷却、取菌 区1划线 灼烧、冷却 区2划线 区3划线 灼烧、冷却 区4划线 完毕、灼烧连续划线法：灼烧、冷却、取菌 连续划线 完毕、灼烧,结果与讨论,计算含菌样品中的所含活菌总数在恒温箱中培养微生物时为何要倒置？,7、斜面接种 选择分离效果较好，认为已经纯化的单菌落，挑选一个，用接种环接种斜面。贴好标签。8、培养 置370C恒温箱中培养24h，置冰箱保藏。,
