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1、现代分子生物学大实验,实验三 总RNA的提取与Northern杂交,实验目的,掌握植物总RNA的提取及凝胶电泳检测的原理及方法并能熟练操作对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取植物的总RNA重点掌握Northern杂交基本原理、基本实验步骤和检测方法利用Northern杂交检测目的基因的时空表达情况，如不同生长发育阶段、不同的组织部位、不同生长环境等条件下相关基因的表达情况,植物总RNA 的提取及电泳检测,掌握植物总RNA的提取及凝胶电泳检测的原理掌握植物总RNA提取的方法并熟练操作用甲醛变性凝胶进行电泳，检测总RNA提取质量对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取植物的总RNA,实
2、验原理,细胞破碎，核酸溶出液氮速冻后，对植物组织进行研磨可以破碎细胞。细胞提取液可溶出核酸。核酸的纯化DNA的去除酚、氯仿抽提使蛋白质变性、沉淀，可去除蛋白。多糖、次生代谢物核酸的保护（内源RNA酶）低温、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制RNA酶的活性，保护RNA不被酶解。,实验设备,常规设备移液器，tip头，离心机RNA电泳金属浴，水平凝胶电泳仪，微波炉，紫外凝胶成像系统紫外分光光度计,实验试剂,RNA提取液100 mmol/L TrisCl pH8.520 mmol/L EDTA pH8.5 0.2M NaCl 1%SDS-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇琼脂糖、MOPS、EB替代
3、品,实验步骤,新鲜植物材料,液氮研磨,抽提液,混匀,酚/氯仿抽提,水层中间层有机层,加入异丙醇沉淀,干燥,水融,反复抽提,实验步骤,向1.5 mL 离心管中加入700L RNA提取液，35L的-巯基乙醇（终浓度5%）。取适量材料，在液氮充分研磨成粉末后，装入离心管中，用力充分混匀。加入苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）各350L，混匀10min，4 8000rpm离心10min。取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），摇床震荡10min，4 8000rpm离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇和1/10体积的5 mol/L NaCl，充分混匀。-20放置20min后4，12000
4、rpm离心10 min。弃上清，70%乙醇洗沉淀，离心，412000 rpm离心5 min。弃上清，通风橱内干燥沉淀。沉淀溶于20 L灭菌水中，备用。,五、实验步骤,RNA浓度测定取1ul RNA样品，加水199ul后读取260nm处的吸光度值260nm处的吸光度值相当于40g/ml单链RNA，以此来计算样品含量。260nm和280nm读数比值（A260/A280）可反映核酸的纯度纯品的A260/A280的值为2.0，低于A260/A280，有蛋白质或酚的污染。,实验步骤,RNA电泳RNA变性处理1ul RNA样品加入2.5ul 上样缓冲液，混匀后65温育5-10min置于冰上冷却（20ul
5、RNA+50ul上样缓冲液）检测RNA的凝胶要配制MOPS甲醛电泳缓冲液为1M0PS,实验步骤,用透明胶带将胶板的两端封好。配制0.8%的琼脂糖凝胶（1.6g琼脂糖于500ml三角瓶中，加入1MOPS 200ml），在微波炉中加热至琼脂糖溶解。10MOPS（MOPS 0.2M，NaAC 50mM，EDTA 10mM，pH7.0）待溶液冷却至60左右，加入10ml甲醛，4ulEB替代品充分混匀。放置合适大小的梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在3-5 mm之间，大约需要凝固20min。,注意事项,特别要注意的是在所有器具严格消毒，实验过程中需要带手套，减少说话和走动等防止RNase的污
6、染，来保证RNA不被降解。,分子杂交核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交及Northern杂交。属于蛋白质分子“杂交”的Western杂交。核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列(或某一区段互补)的两条多核苷酸链，通过WatsonCrick碱基配对形成稳定的双链分子的过程。杂交的双方是待测核酸及探针（probe）待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因组DNA或总RNA被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。,实验原理分子杂交,植物材料,RNA,DNA,合成探针,Southern杂交,Northern杂交,原位杂交,组织切片,分子杂交是进行核酸序列分
7、析，重组子鉴定，及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。要证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是，只有经分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物。同时也可以利用Northern杂交来检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表达情况。,实验原理分子杂交,Northern杂交是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，将它们原位转移到固相膜上，在适宜的离子强度及温度下，探针与膜上同源序列杂交，形成RNA-DNA杂交双链。利用探针中的digoxigeni
8、n和anti-digoxigenin-Ap抗体结合，再通过碱性磷酸酶AP与CDP-star底物作用，检测CDP-star的化学发光间接进行定量分析。若经杂交，样品中无杂交带出现，表明虽然外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。,实验原理Northern杂交,实验原理RNA提取,细胞破碎，核酸溶出液氮速冻后，对植物组织进行研磨可以破碎细胞。细胞提取液可溶出核酸。核酸的纯化DNA的去除酚、氯仿抽提使蛋白质变性、沉淀，可去除蛋白。多糖、次生代谢物核酸的保护（内源RNA酶）低温、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制RNA酶的活性，保护RNA不被酶解。,探针探针序列需
9、与感兴趣的基因互补探针需要有荧光或同位素标记以利于检测长度一般为25-2000bp的DNA或RNA,实验原理 探针制备,gene X,PCR,probe,Northern杂交使用了生物素标记。生物素标记检测是以DIG-dUTP为底物，用随机掺入法进行DNA标记，PCR合成标记有地高辛的探针，然后加入抗地高辛（DIG）碱性磷酸酶复合物 Anti-DIG-AP的抗体，利用碱性磷酸酶和化学底物作用检测到杂交的靶DNA。,实验原理信号检测,核酸分子杂交又可分为核酸在体外与探针杂交（膜上印迹杂交）在细胞内进行杂交（细胞原位杂交）分子杂交可以在液相及固相中进行，目前实验室中广泛采用的是在固相膜上进行的固液
10、杂交。膜上印迹杂交将待测的DNA或RNA分子经琼脂糖凝胶电泳分离后原位转移到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上杂交液（液相）中的探针与印迹到固相膜上的特异片段发生杂交,实验原理,分子杂交的实验涉及到的三项技术核酸凝胶电泳技术印迹技术分子杂交技术分子杂交的实验涉及到的三大内容制备被检的核酸或蛋白质样品(或标本)制备杂交探针印迹及杂交,实验原理,实验设备,常规设备移液器，tip头，离心机RNA电泳金属浴，水平凝胶电泳仪，微波炉，紫外凝胶成像系统紫外分光光度计转膜过程3M滤纸，普通滤纸，尼龙膜，托盘，玻璃板，封口膜，1000克重物，吸水纸，保鲜膜，手术刀片，刀柄预杂交、杂交水浴摇床，杂交袋，封口器
11、洗膜、信号检测摇床，杂交袋，X-光片，暗室，暗盒,实验试剂,RNA提取液（TSE）100 mmol/L Tris-Cl pH8.520 mmol/L EDTA pH8.5 200 mmol/L NaCl 1%SDS PVPP、-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇琼脂糖、MOPS、EB,20SSC:3 mol/L NaCl，1.3 mol/L 柠檬酸钠（PH 7.0）鲑精DNA杂交液：7%SDS，50mmol/L Na3PO4（pH 7.0），2%blocking stock solution，5SSC，50甲酰胺，0.1%Sodium N-lauroyl Sarcoine Buffer
12、 I:0.1 mol/L maleic acid，0.15 mol/L NaCl（pH 7.5）Buffer II:10%blocking stock solution(Anti-dig)Buffer III:0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl(pH9.5)(CDP-star)Washing 1：2SSC，0.1%SDSWashing 2：0.1SSC，0.1%SDS显影液、定影液,实验试剂,转基因烟草叶片烟草的NLF基因及标记基因GUS,实验材料,本部分实验总流程图,实验步骤RNA提取,植物材料,液氮研磨,抽提液,混匀,酚/氯仿抽提,水层中间层有机层,加入异丙醇沉淀,
13、干燥,水融,反复抽提,实验步骤RNA提取,向1.5 mL 离心管中加入700L RNA提取液，35L的-巯基乙醇（终浓度5%），适量PVPP。取适量材料，在液氮充分研磨成粉末后，装入离心管中，用力充分混匀。加入苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）各350L，混匀10min，4 8000rpm离心10min。取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），摇床震荡10min，4 8000rpm离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇和1/2体积的1.2 mol/L NaCl，充分混匀。-20放置30min后4，12000 rpm离心10 min。弃上清，70%乙醇洗沉淀，离心，412000 rp
14、m离心5 min。弃上清，通风橱内干燥沉淀。沉淀溶于20 L灭菌水中，备用。,实验步骤RNA浓度检测,RNA浓度测定取1ul RNA样品，加水199ul后读取260nm处的吸光度值260nm处的吸光度值相当于40g/ml单链RNA，以此来计算样品含量。260nm和280nm读数比值（A260/A280）可反映核酸的纯度纯品的A260/A280的值为2.0，低于A260/A280，有蛋白质或酚的污染。,实验步骤RNA浓度检测,实验步骤RNA电泳,RNA变性处理1ul RNA样品加入2.5ul 上样缓冲液，混匀后65温育5-10min置于冰上冷却检测RNA的凝胶配制MOPS甲醛电泳缓冲液为1M0P
15、S,用透明胶带将胶板的两端封好。配制0.8%的琼脂糖凝胶（0.16g琼脂糖于50ml三角瓶中，加入1MOPS 20ml），在微波炉中加热至琼脂糖溶解。10MOPS（MOPS 0.2M，NaAC 50mM，EDTA 10mM，pH7.0）待溶液冷却至60左右，加入1ml甲醛，2ul溴化乙锭充分混匀。放置合适大小的梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在3-5 mm之间，大约需要凝固20min。,实验步骤RNA电泳,实验步骤Northern 杂交流程,实验步骤,RNA浓度的测定及调整对提取的总RNA进行含量测定（CTAB法）。根据测定的吸光度(A260)进行浓度的调整和稀释（OD26040g
16、/ml)。一般调节总RNA的浓度到1 ug/uL。要求上样量一致。电泳制备大板胶。用15ug样品进行甲醛变性胶电泳(0.8%琼脂糖凝胶)，电压为50V，5h，低电压长时间电泳，使各分子量的mRNA充分分开。紫外凝胶成像检测电泳效果。转膜将电泳好的胶，切去上样孔、两边至合适的大小，放于用20SSC润湿的，无气泡的普通滤纸上，依次放上与胶等大的醋酸纤维膜，3MM滤纸，用玻璃棒或试管轻轻地赶气泡。用封口膜封边，放上叠好的吸水纸，压上约1000 g的重物。烘干转膜过夜后，取出尼龙膜，用铅笔标记上样孔、编号，置于50烘干30min。,交联短波紫外线固定30s。核酸分子中的部分胸腺嘧啶残基与膜上带正电荷的
17、氨基基团相互交联，从而使结合更加牢固 预杂交使非特异性DNA分子及其它高分子化合物不与待测的RNA分子杂交，从而使待测的RNA分子在杂交时能与探针进行特异性结合。鲑精DNA 100，变性5min，之后冰上备用将结合了RNA的硝酸纤维素膜置于杂交袋内并加入5ml预杂交液，25ul变性好的鲑精DNA，排除袋内的气泡后，封口，50恒温水浴，震荡1h。杂交在预杂交袋中加入变性好的的探针5uL，赶气泡，封袋，50水浴震荡过夜。,实验步骤,实验步骤转膜,实验步骤转膜,琼脂糖凝胶,醋酸纤维素膜,预杂交buffer中含有 blocking reagents能占据膜上的可结合位点,实验步骤,实验步骤杂交,实验步
18、骤加入抗体Anti-Dig,实验步骤加入发光底物CDP-STAR,实验步骤洗膜,X光片的曝光将封好的膜放在暗盒中，暗室中在其上放置好X光片，盖好暗盒，X光片曝光45min。显影液、定影液冲洗X光片。观察、分析杂交结果。,实验步骤信号检测,注意事项,RNA提取中要特别注意防止RNA的降解。注意器具的消毒，实验过程中带手套，减少说话和走动等防止RNase的污染，来保证RNA不被降解。准确调节总RNA的浓度，保证上样的质、量。低电压长时间电泳，以保证杂交质量。转膜时应该使所有的RNA分子都转移到尼龙膜上，才能够保证杂交结果的准确性。掌握紫外固定的时间，时间过长会造成核酸的断裂。保证杂交时间和探针的加入量。保证洗膜的质量，保证杂质的洗脱。严格控制曝光时间以得到清晰的杂交结果。,作业,按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验材料、实验用品及药品、实验步骤、实验结果。阐述Northern 杂交的基本原理。分析实验结果。Northern 杂交时注意哪些问题才能够得到好的杂交结果？,实验结果与分析,杂交结果,1,CK;2,200mM Na2CO3处理2h;3,200mM Na2CO3处理 6h;4,200mM Na2CO3处理 12h;5,200mM Na2CO3处理 24h;6,200mM Na2CO3处理 48h;7,200mM Na2CO3处理 72h;8,天然盐碱地,End!,
