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1、生化实验技术,主讲：钱国英 教授浙江万里学院,第一讲 核酸化学实验技术第二讲 蛋白质化学实验技术第三讲 酶学实验技术第四讲 糖类化学实验技术第五讲 脂类化学实验技术第六讲 维生素和辅酶化学实验技术,实验授课内容,课堂理论：课前辅导生化大分子基本性质、提取、分离纯化、含量检测等相关生化物质的分离分析技术。项目任务：设计案例，引导学生去解决案例问题的方式向学生布置项目任务、实验设计和实施要求。实验设计：学生分组查阅资料设计实验方案网上递交教师修改及审核大组讨论评价实验操作：各小组（2人）为单位进行实验试剂、器材的准备，按实验设计完成实验内容操作。实验论文：根据任务要求，每位学生独立完成课程论文。课
2、堂讨论：大组为单位进行全班ppt形式交流汇报,实验实施流程,第一讲 核酸化学实验技术,案例1,目前，人们的生活中充斥了越来越多的转基因产品，如转基因大豆、转基因棉花、转基因玉米、马铃薯、水稻等等。转基因作为一种新兴的生物技术手段，它的不成熟和不确定性，使得转基因食品的安全性成为人们关注的焦点。,问题：如何检测转基因食品？,第一节 实验项目发布与设计方案评价,什么是转基因食品？,转基因食品：以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品。转基因食品利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变。,转基因育种的
3、程序？,标记基因 启动子 外源目的基因 终止序列,载体的构建,转基因食品的核酸检测技术,检测对象：转基因的启动子、终止子、抗性筛选基因、目的基因等外源基因检测方法：普通定性PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片其中以普通定性PCR、实时荧光定量PCR最常用。,核酸定性PCR法检测转基因食品,样品基因组DNA的提取DNA提取质量检测特有序列的PCR琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物进一步验证：测序、PCR产物酶切鉴定、实时荧光定量PCR方法等,一般步骤,核酸定性PCR法检测转基因食品,案例2,某实验人员从土壤中分离筛选出一株产植酸酶的菌株，经形态学和生理生化特性初步鉴定为真菌。真菌种类繁多，地球上大约存
4、在150万种真菌，已经被发现和运用的大约有69000种。,生物遗传物质携带了物种的特异信息，在属种间具有高度的保守性。因此，可应用分子生物学鉴定手段对真菌进行种类鉴定和系统分类。,问题：如何准确鉴定其种属？,图1 真菌rDNA转录区和相关引物,真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA 4种，在染色体上头尾相连，串联排列，相互间由间隔区分隔。18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元（图1），三者高度保守，适合较高等级水平生物群体间的系统分析。其间的间隔区为内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1
5、和ITS2，进化相对迅速，具有多态性，适合较低等级水平的系统学研究。,设计特定引物对该真菌菌株中的基因组中的rDNA转录区的特定核苷酸片段进行PCR扩增，通过对所获得的PCR产物进行测序分析，与已知真菌序列比对即可确定该菌株在系统分类学上的位置。,基于rDNA-ITS序列在真菌分子鉴定中的应用，你如何获得高质量的基因组DNA并鉴定菌株的目的基因序列？,表1 真菌rDNA-ITS通用扩增引物,图1 真菌rDNA转录区和相关引物,真菌rDNA-ITS通用引物,实验设计要求：根据案例提交一个具体解决基因组提取及分离鉴定的实验设计方案，包括从提供的不同材料中提取、分离得到基因组DNA，测定所得DNA的
6、含量、纯度及分子大小，并利用已知引物进行PCR扩增，分析PCR检测的结果。,实验题目：基因组DNA的提取与PCR鉴定,实验项目与任务布置,分组题目,项目1：定性PCR法检测转基因食品项目2：rDNA-ITS扩增法鉴定真菌种类,全班分成4大组，各选一个题目。每个大组3个小组，2名同学一个小组。以大组为单位进行实验准备和讨论。以小组为单位进行实验设计和操作。,实验目标,学习从各种材料（动物、植物组织、微生物）中提取和纯化DNA的原理和操作技术。学习水平式琼脂糖凝胶电泳及紫外检测，确定DNA的纯度、含量与分子大小。学习PCR的基本原理和操作方法。掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪、PCR仪等
7、仪器设备的使用。,实验设计需包含的主要技术内容,基因组DNA提取：可选用浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法、试剂盒法等DNA含量测定：可选用二苯胺法、紫外分光光度法等DNA纯度测定：紫外分光光度法DNA分子大小测定：琼脂糖凝胶电泳PCR技术,实验结果要求,各标准曲线基因组DNA产品得率（mg/100g)基因组DNA产品纯度基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图PCR产物琼脂糖凝胶电泳图PCR产物分子大小（bp）检测结论,基因组DNA提取 4学时DNA的含量与纯度测定 4学时DNA的琼脂糖凝胶电泳 4学时PCR及产物检测 4学时,实验时间安排,课后研讨题,1.DNA提取的方法主要有哪些？并说明各
8、方法的原理。2.结合本人实验操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂？3.查阅资料，说明提取的基因组DNA有哪些方面的用途？4.查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应用和发展。5.琼脂糖凝胶电泳所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。,课后研讨题,6.结合本次实验，说明PCR技术的主要用途和发展。7.通过本次实验，谈谈你对转基因食品安全性的认识。8.查阅资料，说明转基因食品检测的常规方法。9.查阅资料，综述常用的物种分子鉴定技术。10.案例分析：在美国海豹突击队击毙本拉登几个小时后，美国总统奥巴马向全世界宣布拉登已被成功击毙，死
9、者确定为本拉登的可能性是99.9%。查阅资料，根据所学核酸分子鉴定技术，分析如何对其进行法医鉴定。,相关事项,实验习惯 药品配制与保存实验记录实验交流实验论文,Good Luck！,小组上交材料,论文格式模板,研讨课要求,以大组为单位课后总结结果，讨论，制作一份ppt，课内讨论汇报。ppt内容包括：实验背景和目的，实验主要原理，实验条件的选择，各小组实验结果和分析，课后研讨题，实验体会等。,基因组是指细胞内遗传信息的携带者DNA的总体。为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。从各种材料中提
10、取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。真核生物的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质结合构成染色体，原核生物的DNA不与任何蛋白质结合。,理论介绍,一、内容提要,保持基因组DNA结构相对完整：防止各种因素引起的降解。纯度高：尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白质、多糖和RNA等）。得率好：选用合适的方法获得足够量的DNA。,二、分离纯化核酸的总原则,三、基因组DNA提取的原理和方法,裂解细胞，释放DNA,核酸分离纯化,沉淀并吸附核酸,核酸溶解（缓冲液）,准备适宜的材料,去除蛋白质、RNA等杂质,细胞破碎,细菌溶菌酶（降解细胞壁），EDTA（抑制DNA酶，防止DNA降解），去垢剂SDS（破坏细
11、胞膜）酵母破壁酶或液氮研磨植物材料液氮研磨（使细胞冻结，用研钵碾制成粉状）动物组织匀浆或液氮研磨,化学法、机械法、生物法,DNA与蛋白质的分离,SDS：真核生物的DNA与组蛋白结合形成DNP，SDS能够破坏DNA与蛋白质之间的静电引力或配位键，可使DNA与蛋白质解聚，释放出DNA。CTAB：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在高盐溶液（NaCl0.7M）中是可溶的，当NaCl降低到0.3M 时，可沉淀CTAB-核酸复合物。苯酚-氯仿-异戊醇：苯酚、氯仿能变性蛋白质，离心分层，DNA溶于上层水相，变性蛋白质位于水相和有机相之间。异戊醇可减少抽提过程的泡沫产生。,1.DNP中D
12、NA与蛋白质的分离,2.蛋白质的去除,核酸分离纯化,RNA的去除,用不含DNA酶的RNase处理，使RNA降解。添加RNase处理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽提，离心除去蛋白质及寡核苷酸。,核酸分离纯化,含DNA的水相可用1倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇沉淀。基因组的大分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用吸头将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附在壁上及底部。如果DNA沉淀量少或无法捞出，可离心获取沉淀。沉淀DNA前，为提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸铵等盐类促进沉淀。获取的沉淀需再用70%乙醇洗涤除去残留的有机物、无机盐等。,沉淀并吸附核酸,基因组DNA提取注意事项,使用新
13、鲜、幼嫩的材料；材料应适量，过少造成核酸提取量少，过多影响裂解，导致DNA量少。（推荐0.2-5g）。简化操作步骤，缩短提取过程，避免物理、化学和生物的因素对核酸的降解，如机械剪切力、高温和DNase等酶，防止过酸、过碱，避免剧烈振荡和混合。采用酚-氯仿抽提时应采用上下颠倒的方法充分混匀，但动作要轻柔，离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。沉淀DNA用的异戊醇、乙醇事先放入-20冰箱，待用时取出。,特别注意,液氮研磨时为防止冻伤，需戴棉线手套操作，研磨越细越好。苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套。一定要搞清提取原理，知道每一步操作DNA所在的位置，防止出错。,四、基因组DNA的
14、检测,1、二苯胺显色法测定DNA浓度 二苯胺法定量测定DNA的原理为：在强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中，2-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA含量成正比。,详见教材：实验二十二 二苯胺显色法测定DNA浓度,2、紫外分光光度法测定DNA含量 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。DNA的紫外吸收峰为260nm。一般在260nm波长下，在pH7.0时每毫升含1g DNA溶液的光吸收值约为0.
15、020。故测定待测DNA溶液260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。,详见实验课件：核酸定量测定,3、紫外分光光度法测定DNA纯度 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。DNA纯度的判断根据OD260/OD280值判断，符合要求、纯度高的纯化DNA其比值为1.8。如果样品中污染有蛋白质或酚，其OD260/OD280将明显低于此值。此时无法对样品中的核酸进行精确定量。,4、琼脂糖凝胶电泳法测定DNA分子大小 电泳是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。不同大小、不同形状和不同构象的
16、DNA 分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色。,详见实验课件：DNA的琼脂糖凝胶电泳,五、PCR检测技术,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR），是一种选择性的体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。,PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成：,模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。,PCR反应示意图,重复循环：变性退火延伸这三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。,PCR动画演示,
