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1、高效液相色谱技术及应用,液相色谱高级培训班,林子俺博士福州大学化学化工学院食品安全分析与检测教育部重点实验室福建省食品安全分析与检测技术重点实验室2011-9-15,目前已发表SCI论文二十余篇，代表性论文：(1)Anal.Chem,2006,78,5322-5328(IF=5.9);(2)J.Chromatogr.A,2007,1170,118-121.(IF=4.2)(3)J.Chromatogr.A,2009,1216,8612-8622.(IF=4.2);(4)J.Mater.Chem.,2011,21,518-524.(IF=5.1)(5)J.Chromatogr.A,2010,12
2、17,4507-4510.(IF=4.2);(6)Chem.Commun.,2011,47,9675-9677.(IF=5.8);,林子俺，1977年出生，博士，副教授，硕导，师从色谱专家张玉奎院士，药物分析硕士学位点负责人。研究方向：（1）新型色谱整体材料/磁性纳米材料/生物大分子印迹材料的制备及其在蛋白组学中的应用研究;（2）面向蛋白质组学的液相色谱/毛细管电泳/电色谱联用技术研究；长期担任Journal of Chromatography A,Analyst,Talanta,Journal of Separation Science,Recent Patents on Nanotechn
3、ology,Separation Science&Technology,Current Pharmaceutical Analysis,环境化学等国内外知名刊物评审人。目前，已在国际权威刊物上发表SCI论文20多篇，申请国家发明2项。,主持科研项目：1.国家自然科学基金2.教育部博士点（新教师类）基金3.中国博士后基金4.福建省自然科学基金5.福建省教育厅基金6.校科技发展基金,内容简介,1 液相色谱基本概念色谱发展概况色谱分离原理色谱基本理论2 液相色谱仪器系统及应用输液系统进样系统分离系统检测系统数据输出系统3 液相色谱方法开发和优化色谱方法的选择色谱条件的优化案例分析4 液相色谱常见问题
4、及其解决方法化学因素机械因素,色谱起源,M.S.Tswett,1906年，俄国植物学家M.S.Tswett 命名这种应用吸附原理分离物质的新方法为色谱(Chromatography)；,60年代末，高效液相色谱（HPLC）崛起；,21世纪，超高压色谱、多维色谱等出现，使得色谱技术进入了飞速发展阶段；,1952年，James和Matrin发明了气相色谱法；,色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术；流动相：携带样品流过整个系统地流体；固定相：静止不动的一相，即色谱柱；,液相色谱分离原理,色谱法的分离原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(st
5、ationary phase)发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。,吸附：物质在两相界面上浓集的现象,色谱分类,分配色谱：是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。吸附色谱：分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝。,定义不同,色谱分类,色谱研究方向,高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography(HPLC)气相色谱Gas Chromatography(GC)薄层色谱Thin-Layer Chro
6、matography(TLC)凝胶电泳Gel Electrophoresis(GE)毛细管电泳Capillary Electrophoresis(CE)毛细管电色谱Capillary Electrochromatography(CEC),（1）分配系数,（2）容量因子“k”：或：“k”是比“tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体积比）有关。“k”又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素，而分配系数“K”是平衡时物质在两相中的浓度比。k值的范围：0.4k2030；k25为佳，过大则耗时
7、太长。,思考：为什么要优化流动相比例？,KAKB 或kAkB 是色谱分离的前提!,柱效,柱效率（热力学）：定义：理论塔板数(每米柱效)：标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。为便于测量，改用半峰宽：W1/2(或2t1/2)最常用的计算式：另一计算式：（Wb不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。),H,范氏方程(动力学)：1、柱内展宽：H=A+B/+C(A：涡流扩散 B：纵向扩散 C：传质阻抗)气相GC中B=2rDm中Dm比HPLC中大105倍 在HPLC中第二项可忽略，故高效液相色谱的范氏方程为：H=A+C,初始,带宽,最终,带宽,A,A=涡流扩散多径扩散,仔细填充柱
8、子,使用粒径均一的载体,线 速 度,H,E,T,P,扩散,扩散,B,B=自由分子扩散纵向扩散,在液相中影响小,在低流速中影响大,线速度,H,E,T,P,扩散,滞流的流动相,流动相,固定相,C,.,u,C=传质阻力,在低流速下可以降低传质阻力,使用小颗粒载体可以降低传质阻力,H,E,T,P,线速度,总原则：固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。流动相粘度低。低流速。,HPLC分离模式,近年来新的HPLC法应运而生我们仅讲其中部分内容：,HPLC 高效液相,LSC 液固,LLC液液,IEC离子交换,SEC空间排阻,AC亲和色谱,CE毛细管电泳,BPC化学键合相,NPBC正,RBPC反,PIC离子对,
9、ISC离子抑制,液相色谱仪器系统及应用,HPLC硬件基础知识 日常应用注意事项,液相系统维护流程图,色谱柱,5大系统：（1）输液系统；（4）检测系统；（2）进样系统；（5）数据处理系统；（3）分离系统；,接头,不锈钢接头/垫圈 主要用于输液泵、进样器的连接能承受 400 kgf/cm2压力一旦固定，垫圈不可再动PEEK接头 主要用于色谱柱、检测器的连接易于安装能承受 250 kgf/cm2压力容易产生死体积,不锈钢接头,垫圈,PEEK接头,输液系统,死体积,死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.,管线,公螺母,死体积,好的连接,差的连接,选择原则采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效
10、损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配,流动相,溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒）,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,流动相,有机溶剂的等级,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,分析纯,色谱纯,水的等级纯化水蒸馏水去离子水,波长(nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,流动相,水的等级,未注入样品时空白梯度的色谱图,水中的不纯物保留在柱中，随
11、之被乙腈洗脱.,选择缓冲液的步骤 1.确定最佳分离状态时的流动相pH 2.选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）3.确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和 柠檬酸的缓冲液）,流动相,缓冲盐,常用代表性的弱酸的pKa值,缓冲液的使用,使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇 冲洗30min 用纯水冲洗泵头清洗管路 易受到细菌和霉菌的影响,不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液,缓冲液,流动相的更换,不互溶的流动相不能直接更换,缓冲盐不
12、能直接用有机溶剂更换,水,正己烷,异丙醇,缓冲盐,有机溶剂,水,过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂,溶剂前处理,吸滤头,材料：不锈钢(或陶瓷)烧结，孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或5稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗,溶剂前处理-脱气,脱气：除去
13、流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动,溶剂前处理-脱气,常用脱气方法,超声脱气 减压脱气 在线脱气,岛津液相输液泵,柱塞泵的基本结构,LC-10ATvp LC-20AT串联式柱塞往复泵,LC-10ADvp LC-20AD 并联式微体积柱塞往复泵,LC-20AT,LC-20AD,LC-20AB,柱塞往复泵结构示意图,单向阀工作原理,单向阀结构,请不要分解阀心A和阀心B重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定,注意：,单向阀清洗,故障：宝石球或球座受污导致密封不好表现：系统压
14、力波动大措施：打开排液阀，以异丙醇为流动相输液拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗,注意：超声清洗时开口端向上放置。,故障：宝石球粘附于垫片表现：泵无法吸液或排液，流路不通措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球 与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗,单向阀清洗,等度洗脱,梯度洗脱,高压/低压梯度系统,梯度洗脱装置：高压（外）梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入 低压（内）梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。,使用梯度洗脱的原因,使用梯度洗脱的原因,样品前处理,1.使用流动相溶解样品 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂
15、峰时尤为重要 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中 尤其在柱中产生沉淀 2.进样前最好使用0.45um 的滤膜进行过滤 如果样品很脏，要使用0.22um的滤膜进行过滤 3.对于含有复杂基质的样品，最好前处理后再进样。,进样器,自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入 2）部分注入,7725i手动进样阀,手动进样器的原理图,7725/7725i手动进样器结构图,定子密封部件号：228-32211-31,转子密封(Vespel)部件号：670-12098-51(Tefzel)部件号：670-12098-56,转子密封适用范围,手动进样器的进样体积,部分注入和全量注入,
16、部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20 l的 定量环最多进样10l的样品，并且要求每次进样体积准确、相同 全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20 l的定量环 最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残 留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。,交叉污染的原因,红色表示残留样品,进样口清洗,（1）将附件进样口清洗器连接在针管上，不应使用微型注射器清洗。（2）清洗液（试样溶剂或不含盐的流动相 等）用注射器吸入（3）在进样状态下，将针孔清洗器压接在 针导管上，流入清洗液1ml左右（4）使用缓冲盐后，用水清洗流路和针孔（5）清洗液可能反喷，因此注射器应慢慢
17、地推压,手动进样器,操作注意点：1）进样时，进样针应插到底2）不使用时将针头留在进样器内3）进样应使用液相色谱专用平头进样针4）样品溶液pH小于10,常用密封垫的Vespel材质，适用pH10,否则换Tefzel或PEEK材质的密封垫pH 0-145）清洗应使用专用针口清洗器,柱温箱,分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性,色谱柱化学及外形结构的关系,对HPLC柱的了解（一）,平均颗粒度，颗粒度分布颗粒度(dp)颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布颗粒分布越宽柱效低(渗透性差)颗粒形状球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型：柱床结构不均匀 流动
18、相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱的了解（二）,平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布大的孔径可分析高分子量的分子,对HPLC柱的了解（三）,键合相化学影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同可能导致色谱的分离机理不同如：C18、C8、CN,对HPLC柱的了解（四）,含碳量含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好，重现性好有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗,对HPLC柱的了解(五),填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）,残基处理的效果,NovaPa
19、k C18,未封口 C18,抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺,对HPLC柱的了解（六）,硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：k生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小是色谱柱质量好坏的重要标志,对HPLC柱的了解（七）,填料的稳定性硅胶填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2时键合相水解,ODS柱的使用注意点,柱压低于20MPa 柱温在40左右，最高使用温度为50 缓冲液pH使用范围为27.5流动相有机溶剂比例过低,柱效下降快 硅胶在pH为34时稳定性最好 碱浓度越低，流动相含
20、水量越低，硅胶越稳定。活化再生：水乙腈氯仿（或异丙醇）乙腈水,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,分析柱的维护,在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 min，长时间未用的分析柱也要同样处理 定期使用强溶剂冲洗柱子 使用缓冲盐时，要先用含5%甲醇的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗 净化样品 分离条件 不使用时，要盖上盖子，避免固定相干涸,常用检测器,紫外检测器（包括二极管阵列检测器）荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器,紫外检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外
21、光的选择性吸收 定量基础：朗伯-比耳定律，A kCL 优点：1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,二极管阵列检测器,二极管阵列检测器,二极管阵列检测器（SPD-M20A）二十一世纪标准紫外检测器 色谱定性依据：保留时间 常规紫外检测器 峰纯度 二极管阵列检测器,二极管阵列检测器,UV/Vis 与DAD 检测器区别,Instrumentation-Absorbance,Detectors,二极管阵列检测器的优点,1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未检测到的峰,荧光检测器,原理：基于被分析组分发射的荧光
22、强度进行检测。优点：灵敏度高，是最灵敏的检测器之一 选择性好 对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质 可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿 茶酚氨等（具有对称共轭体系）,示差折光检测器,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；,电导检测器,原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导率的变化来测定电离物质含量，广泛用于离子色谱法。优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
23、可用于梯度洗脱 缺点：对温度变化敏感（温度每升高1度，电导率增加2%-2.5%)用途：主要用于离子色谱，检测无机和有机离子,蒸发光散射检测器,原理:流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液 滴，溶剂挥发后，溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统，进入散射室中，检验散射光的强度。优点:消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移，可梯度洗 脱，灵敏度高，是HPLC的通用型检测器 缺点：不能使用不挥发性盐作流动相，如磷酸盐,质谱检测器,强大的定性和选择性能力 多组份样品的准确定性；未充分分离组份峰的鉴别；消除杂质干扰；可作为便捷的定性分析 用于合成和衍生反应的研究；作NMR预分析的质谱鉴定；,液相色谱方法的
24、开发和优化,案例分析,选HPLC参数时的基本考虑,溶解度-选择流动相的条件分子量-在样品预处理或GPC分析时有用官能团-有否离子化基团?保留特性如何?样品的基质-考虑如何前处理在基质中样品的含量-分析、制备都考虑检测特性-有否紫外吸收?荧光?找出样品中不同组份之间的差异,摸索条件的重要线索!,HPLC分析方法开发,分析方法开发三步骤,1、选择合适的色谱柱(固定相)；包括：填料（C18、C8、C4）、柱长、粒径、孔径等。,a)一根短的色谱柱可以减少方法开发时间；b)较小的色谱柱填料粒径可以在短时间内提高所需的分离度；c)端基封尾色谱柱可以改进分离结果 更好的柱效和峰形；,2、选择合适的流动相；选
25、择简单的流动相 可靠，并适用多种样品。,a)水相：磷酸缓冲液pH 3,三氟乙酸,或甲酸；b)有机相：乙腈或甲醇；,3、调速流动相得到更理想的保留和分离度；流动相配比、pH优化、流速优化等。,a)所有的峰有适当的分离度(Rs 2.0)相应较高的柱效；b)第一个峰的保留值最好至少等于1；c)分离时间在20分钟内 更短；,案例 1,在最开始时如何制定方法开发方案?,使用两个重要参数改变选择性以提高分离度 流动相和键合相,键合相(提供多种最优化方法的可能)很多种选择C18 C8,Phenyl,CN等 C18-aq 柱可以用于100%水相的流动相体系 选择新的色谱柱得到更好的峰形流动相(改变的第一选择，
26、因为最易行)流动相 有机相(乙腈,甲醇等)流动相 pH 在一个更宽的pH范围 有时会是pH 1-12,好的液相色谱柱所应具备的性能,好的峰形尤其对于碱性化合物,可以不加额外的流动相添加剂 减小拖尾因子以提高分离度和定量准确性高的柱效 1.8um,3.5um和5um，不同的颗粒粒径可以满足任何分离的柱效要求柱效N 采用柱效进一步优化分离度好的选择性 C18是最受欢迎的键合相，且适用于大部分化合物的分离 C8 是在C18之后的受欢迎的键合相在较宽的流动相范围内均可使用简化方法开发适于更多的应用出色的重现性 不同批次的色谱柱都有很好的重现性好的使用寿命 至少能分析1000 个样品,案例 2,ZORB
27、AX Eclipse Plus 色谱柱,改进所带来的好处:更好的峰形 对于大部分的碱性化合物 对于大部分的流动相无需额外的添加剂 与其它色谱柱相比对于除了碱性化合物之外的样品同样也有更好的峰形和更好的柱效 酸碱混合物 中性化合物,案例 3,案例 4,流动相的调整“秘诀”,Propranolol 心得安,-阻滞剂(-blocker),Pindolol心得静,案例 5,Dipyridamole双嘧达莫,血管扩张药物(Vasodilator),Disopyramide 达舒平,抗心律不齐药物(Anti-arrhythmic),Diltiazem 合心爽,钙通道阻滞剂(Ca+channel block
28、er),总原则：中性化合物无需调整流动相的pH值；而对于含有带电基团的化合物，则需要用缓冲溶液调整流动相的pH值；有时需要采用离子对反相色谱！,案例 6,案例 7,案例 8,出峰顺序不同,液相色谱常见问题及其解决方法,色谱问题的可能根源,流动相进样器在线过滤器色谱柱检测器样品,泵保护柱连接管线及接头软件其它偶然因素,学会逻辑判断-将会节省解决问题的时间！,解决色谱问题的策略,色谱柱保护柱流动相样品/样品瓶问题,泵进样器检测器数据采集谱带展宽/连接,最易发生故障！,判断故障与故障排除的原则,规则一:确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实是问题规则二：从最简单的因素入手规则三
29、：一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联规则四:恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题之所在，完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则，换下的组件将来很难再利用，会造成浪费规则五:养成记录的好习惯。一个完整的好记录是成功地进行故障排除的关键,HPLC中常见问题分类,H P LC系统压力问题 压力高 压力低或没有压力 压力不稳流路基线噪音问题 基线不稳定(不重复)长、短程振荡 基线漂移 噪音脉冲尖刺,关于色谱系统的反压,什么是反压(back pressure)流动相流经管路及色谱柱时会有阻力，即所谓的反压，又称系统反压或系统压力 常用单位有:Psi,Bar,Mpa(1Bar=
30、0.1Mpa=14.5Psi)影响系统反压的主要因素:流动相的溶剂组成 温度 流速,反压与溶剂组成的关系,流动相的粘度是产生反压的主要原因有机溶剂一水的粘度随组成而改变其压力随组成变化如下图所示,反压与流速的关系,流速对反压的影响是线性关系流速增加，反压亦增大下图的实验条件:2.1 x 30mm Symmetry C18柱，20,反压与温度的关系,温度对反压的影响是反比关系温度升高，反压降低，对某些流动相的影响更大一些,影响系统反压的其他因素,反压与色谱柱长度成正比反压与填料颗粒度的平方成反比2.5m填料比3.5m填料反压高反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)反压与管路的长度成正比,HPL
31、C系统压力问题分析（1）,问题:系统压力高可能的原因:温度太低流速太高流动相粘度大管路堵塞仪器或色谱柱堵塞压力传感器问题,HPLC系统压力问题分析（2）,问题:压力低或没有压力可能原因:温度太高;流速太低泵关闭或保险丝断了泵未输送流动相系统内有渗漏处所用溶剂不正确自动进样器在Purge时卡住,储液瓶中无溶剂低压限设置不当泵未正确排气溶剂入口过滤头堵入口管路中有空气泵失效压力传感器问题,问题:压力不稳可能原因:泵排气不充分泵失效流动相未正确脱气所用溶剂不混溶或易挥发,HPLC系统压力问题分析（3）,HPLC流路基线噪音问题,基线不稳定(不重复)检测池中有大的气泡流路中有小气泡流过系统未稳定或未达
32、到化学平衡流动相被污染检测器流动池漏色谱柱污染,HPLC流路基线噪音问题,基线漂移系统不稳或未化学平衡温度波动流动相未正确脱气流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化检测器流动池漏;系统中有渗漏色谱柱污染;固定相渗漏选用不正确的检测波长(相对于溶剂)有迟流出的组分,Time(min.),HPLC流路基线噪音问题,短程振荡 泵压不稳 泵入口管松，弯或堵塞 溶剂混合不充分 检测池中有大气泡 泵入口阀脏或失效 泵柱塞杆密封垫磨损 检测器出口溶液成滴状流入废液瓶,HPLC流路基线噪音问题,长程振荡 温度波动 溶剂被循环通过系统噪音脉冲尖刺 流路中有小气泡 泵头有气泡空腔 入口阀脏或失效 检测池中有小
33、颗粒物 泵或检测器未正确接地,无规律基线噪音,气泡-流动相脱气气体滞留在检测器中 流动相脱气 对检测池加一定的反压泄漏-修复泄漏，更换接头混合问题-增加系统体积管线阻塞 疏通管线，冲洗系统电问题 改变电路，去除根源,有规律基线噪音,几乎都由色谱泵引起泵头中有气泡-做泵排气并重做溶剂脱气单向阀脏或失效-清洗或更换之柱塞杆密封垫漏液-更换柱塞杆损坏-更换混合问题-增加系统体积电噪音-改变电路，去除根源,色谱图常见问题分类,色谱图常见问题主要有三类色谱峰峰形异常问题 例如负峰，宽峰，肩峰，双峰，峰形不对称等色谱图中多峰少峰问题 色谱图末出峰，出峰比预想的多等色谱峰保留时间问题 保留时间不稳定等,色谱
34、图峰形问题,HPLC最常见的问题表明目前状况并未得到最佳的色谱柱性能变形的色谱峰会导致:积分不准分离度不佳灵敏度下降,色谱图峰形问题示例,色谱峰形问题的来源,色谱柱毁坏溶解样品的溶剂不当第二种相互作用色谱柱过载质量过载体积过载其它柱外效应管路连接采样速率时间常数,色谱柱状态机械因素,良好填装的色谱柱,良好的色谱结果,表明:系统、色谱柱、连接状况皆良好,填装良好的色谱柱,峰形问题：色谱柱坍塌,色谱柱填料坍塌（产生死体积）,可能的原因:振动使柱床破坏 高pH流动相使填料颗粒溶解,所有的峰都变形!,色谱峰形欠佳的其他原因,色谱峰形问题:展宽且拖尾的色谱峰色谱柱进口过滤器(筛板)部分阻塞解决办法：卸下
35、接头在线过滤器污染解决办法：更换筛板保护柱污染解决办法：更换保护柱或柱芯,所有色谱峰都变形,化学问题：溶解样品的溶剂不当,部分色谱峰形不正常,由于第二种相互作用的发生，使碱性物质峰形拖尾酸性及中性物质峰形对称碱性物质峰形拖尾,碱性物质峰拖尾,不同品牌色谱柱的硅醇基活性的差异pH因素,拖尾是由什么引起的？,混合型保留机理-第二种相互作用与键合相的疏水作用与硅胶带电点的离子交换作用,缓冲液的pH与拖尾,色谱峰形异常问题分析（1）,所有的峰均为负峰信号电缆接反或检测器输出极设置颠倒光学装置尚未达到平衡一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收(RI或UV)
36、低于流动相,色谱峰形异常问题分析（2）,所有的峰都是宽峰系统未平衡或未达到化学平衡溶样的溶剂比流动相强很多色谱柱类型或尺寸不正确色谱柱或保护柱被污染或降级温度变化对色谱柱的影响,色谱峰形异常问题分析（3）,较早洗脱的峰呈宽峰进样体积过大或样品浓度太高进样器有问题;定量环(Loop)大小不合适在线过滤器，保护柱，色谱柱或管路堵塞管路问题:内径不对或切管不正确管路连接问题:接头或锥箍不正确检测器时间常数不正确,峰展宽/浓度（质量）过载,当上样量超过一定限度时发生-注意峰起点提前,峰展宽/体积过载,进样体积对色谱峰形的影响,峰展宽/体积过载,峰展宽/体积过载,连接管线内径对系统谱带展宽的影响过长的管
37、线亦会造成较大的谱带展宽,峰展宽/柱外谱带展宽,峰展宽实例：管线内径对柱效的影响,色谱峰形异常问题分析（4）,色谱峰峰形异常问题:峰比预想的小样品粘度过大进样器有问题或进样体积有误检测器设置不正确，定量环(Loop)体积不正确检测器输出末置零用了不正确的检测器输出信号检测池被污染检测器的灯可能有问题,色谱峰峰形异常问题:双峰或肩峰进样量或样品浓度过大保护柱或色谱柱进口堵塞保护柱或色谱柱污染或失效前伸峰进样量或样品浓度过大溶样的溶剂相对于流动相太强保护柱或色谱柱污染或失效,色谱峰形异常问题分析（5）,色谱峰形异常问题分析（6）,色谱峰峰形异常问题:平头峰检测器设置不正确进样体积太大或样品浓度太高
38、拖尾峰保护柱或色谱柱问题:污染或失效进样问题检测器时间常数不正确,色谱图多峰少峰问题分析（1）,色谱图中未出峰进样问题:未进样或样品分解流动相问题:泵未输液或流动相不正确检测器设置不正确，或检测器有问题色谱图中出峰比预想的少样品分解色谱柱柱效丧失用错流动相梯度洗脱时平衡不足(例如;过早将手动进样器扳至Load位置),色谱图多峰少峰问题分析（2）,色谱图中出峰比预想的多(鬼峰)样品分解或制样时导入了杂质流动相被污染，或用错流动相流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化前次进样的后流出物(某些Rt值特别大的组分)进样器被污染，洗针系统出问题或注射器脏未充分平衡进样器Loop管保护柱脏，色谱柱被污染，分辨
39、率下降,额外的色谱峰,污染物来源:样品，样品瓶，瓶垫等,额外的色谱峰,额外的色谱峰,色谱峰保留时间问题分析（1）,保留时间飘忽不定(各次运行之间)系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳(泵头里有气泡)进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染,色谱峰保留时间问题分析（2）,保留时间增加或减少(各次运行之间)系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染，柱效下降流动相被污染溶剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏,色谱峰保留时间问题分析（3）,保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)环境温度变化;柱温不正确色谱柱尺寸或类型不正确色谱柱被污染流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化输液系统的梯度滞后体积不正确,反相色谱：保留时间与pH的关系,非离子化状态会造成更多的保留，中性物质的保留与pH无关,保留时间的重现性：pH的影响,化学因素中性物质:无影响酸性物质:pH增加，保留降低碱性物质:pH增加，保留增加0.1 pH的变化会导致高达10%的保留时间变化。(pH在pKa1之内保留时间变化最大),pH稳定区域：方法稳定性更好,Thank you for your attention,
