液相色谱柱的应用与维护.ppt

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1、,液相色谱柱的应用与维护,月旭材料科技（上海）有限公司技术部经理：陈再洁,LC色谱柱的选择热点应用LC色谱柱的维护,色谱柱的选择,高效液相色谱柱发展史,19世纪70年代中期，10 m 的无定型硅胶颗粒。80年代：粒径为5 10 m 球形硅胶。90年代早期：粒径为 5 m 的高纯硅胶。90年代后期：发展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅胶。21世纪早期：粒径小于 2 m 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶基质填料主要为 B 型硅胶。,优秀的色谱柱是一切的开始,液相色谱柱的结构,结构：（厂家之间略有不同）柱体：不锈钢，玻璃，聚四氟乙烯

2、等 填料：化学键合的硅胶，树脂，凝胶等 滤帽：不锈钢烧结成不同孔径的筛板+PEEK帽子 柱头螺丝：与柱体匹配的螺帽 塑料堵头：各种颜色的塑料螺钉,色谱柱选择-不同的基质,硅胶基质 A型 无定形，纯度较低 B型 球形高纯度硅胶 E型 Ec型 极性基团封尾 Eb型 十八烷基中嵌入极性基团 其它型 空间位阻保护、多键键合技术、杂化颗粒技术等 高分子微球 苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(PS-DVB)、聚乙烯醇、聚酯、DVB等 微粒多孔碳 天然“反相”填料 氧化锆 三氧化二铝 无机载体包覆聚合物 其它,反相（非极性）键合相 不同链长的烷基（C1 C30）、苯基（氟代苯基、苯丙基、苯基己基等）、等 正相（极性

3、）键合相 硅胶（SiO2）、氨基（NH2）、二醇基（Diol）、氰基（CN）等 离子交换键合相 阳离子交换剂（磺酸基或羧酸基）、阴离子交换剂（季铵基或氨基）手性键合相 蛋白类，环糊精及其衍生物类、糖类、纤维素类、淀粉类等 等,色谱柱选择-不同的键合相,分离的机理,极性电荷分子大小,基于极性的分离,相似相容 样品中和固定相柱填料极性相似的化合物将被填料强烈吸引而延迟出峰，而和流动相极性相似的化合物将被流动相吸引而较快出峰。,基于极性的分离,正相色谱 固定相的极性大于流动相。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。固定相：SIO2、二醇基、氨基、氰基等；常用的流动

4、相：正己烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙醇等弱极性溶剂；,基于极性的分离,反相色谱 固定相的极性小于流动相。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。固定相：C30、C18、C8、C4、苯基等；常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃等极性溶剂以及各种缓冲盐。,月旭公司反相色谱柱的选择流程,基于极性的分离,亲水作用色谱HILIC 是正相色谱的一种变化；适用于分离和洗脱在正相模式下强保留或反相模式下弱保留的极性化合物；固定相：SIO2、二醇基、氨基、氰基等；常用的流动相：水、甲醇、乙腈等极性溶剂以及各种缓冲盐。,基于电荷的分离,离子交换色谱 用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子;固定相

5、易离子化的官能团（磺酸基、季铵基、羧酸基、二乙氨乙基）键合在硅胶或者聚合物基质上；流动相 各种缓冲盐水溶液、甲醇、乙腈等,基于分子大小的分离,排阻色谱法-（凝胶过滤色谱法（GFC）和凝胶渗透色谱法（GPC）利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等固定相凝胶（葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶）流动相GFC：有机溶剂；GPC：水。,色谱柱的参数,柱长，内径：例如250*4.6mm等粒径：3um,5um,10um等孔径：100A，120A，200A，300A，等比表面积：180m2/g-350m2/g（Ultimate为320m2/

6、g）基质：硅胶，聚合物等硅胶表面性质：载碳量，10-20%(Ultimate C18为17%)键合相：C18,C8,CN等封尾：双峰尾pH稳定性：如Xtimate系列为1.012.5,色谱柱的参数,柱长，内径：例如250*4.6mm等粒径：3m,5um,10um等孔径：100A，120A，200A，300A，等比表面积：180m2/g-350m2/g（Ultimate为320m2/g）基质：硅胶，聚合物等硅胶表面性质：载碳量，10-20%(Ultimate C18为17%)载氮量，4%键合相：C18,C8,CN等封尾：双峰尾pH稳定性：如Xtimate系列为1.012.5,硅胶性质,-纯度 高

7、纯硅胶（99.999%）,对碱性和强极性化合物的分离有极大的影响,M Si,O-H,内部的金属对表面硅羟基具有活化作用,强酸性,-硅羟基 硅羟基的酸性较大，可与碱性化合物由于静电作用力而牢固的结合，因此含有较多残留硅羟基的填料在分离碱性化合物时容易产生脱尾、变宽、保留延长等现象。,硅胶表面性质,解决方案加入适当的扫尾剂如三乙胺可以掩蔽残留的硅羟基，使碱性化合物峰形变好 降低流动相pH值小于3,可以减小硅羟基的反应,从而减小拖尾现象目的残留的硅羟基影响最小；碱性化合物不拖尾；改善选择性；一般优先使用高封尾的色谱柱；低封尾或不封尾的C18色谱柱，可用于100%的水相，因为硅羟基的影响，对极性相同的

8、化合物有特殊选择性（LP系列（pH18）未封尾）；pH使用范围宽。不足点酸性条件下，氢离子通过未封端的Si-OH 的间隙进攻-Si-C键，导致填料水解；封尾的基团会影响色谱柱的使用pH值、对化合物的选择性等；,热点应用,为什么需要制样？,浓度太低-被测物浓度低于定量限样品太“脏”-基体中含有其它组分，干扰测定太“危险”-污染物可能成为“色谱柱杀手”,采样 GC,HPLC,or LC-MS/MS 分析,X,原初样品=不适合进一步分析!为什么?,真实世界中的真实样品,鳄梨中的农药残留分析（不用SPE）,样品前处理过程中的常用技术,稀释进样过滤基质沉淀平衡透析/超滤液液萃取固相微萃取)固相萃取(离线

9、/在线)逆流色谱分子印迹技术（MIPs）免疫亲和色谱,弱的选择性样品净化浓缩效果差更强的选择性样品净化浓缩效果最佳,与液液萃取相比，SPE的优势,样品处理量增加减少有机溶剂用量和有机废弃物的产生增加回收率，改善重现性纯化提取物无乳化现象多种不同选择性可自动化处理,多农药残留分析QuEChERS方法,15g样品加入50-mL离心管（1）,加入 10-mL含1%乙酸的乙腈+内标（2）,加入WEL-QE-02盐析包，剧烈震荡1min（4）,剧烈振摇1 min（3）,4000rpm离心5 min（5）,移取上清液待净化,样品：菠菜,一、萃取,多农药残留分析QuEChERS方法,1ml萃取上清液于2ml

10、离心管中（6）,加入盐析包 WEL-QC-1102（7）,剧烈振摇1 min（8）,13000rpm离心2 min（9）,二、净化,用 GC-MS 分析,多农药残留分析QuEChERS方法,三、上机检测,气相色谱条件进样口：不分流色谱柱：WM-5ms 气相柱 30 m0.25 mm,0.25 m载气：氦气(恒压)柱温：70(2 min),25/min升至150(0 min)程序：3/min 至 200(0 min),8/min至280 进样量：1.0 l质谱仪条件模式：SIM离子源、四级杆传输管线温度：分别为230、150 和280 溶剂延迟：3 min,多农药残留分析QuEChERS方法,四

11、、谱图,多农药残留分析QuEChERS方法,五、数据,多农药残留分析QuEChERS方法,菠菜提取液中不同浓度 Welchrom GraphiCarb 的净化效果,地沟油中PAH的检测,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：月旭Ultimate PAH,4.6250mm，5m检测波长：220nm流动相：A：水 B：乙腈梯度程序：0-20min 40-100%B 20-33min 100%B 33-34min 100-40%B柱温：25流速：1.5mL/min进样量：10L,食品中PAEs的检测,仪器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色谱柱：月旭Ultimate AQ-C18,4.6250m

12、m，5m检测波长：230nm流动相：A：水 B：乙腈 梯度洗脱柱温：30流速：1mL/min进样量：10L,1、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）2、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）3、邻苯二甲酸二丙酯（DPRP）4、邻苯二甲酸丁卞酯（BBP）5、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）或邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）6、邻苯二甲酸二戊酯（DPP）7、邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）8、邻苯二甲酸二己酯（DNP）9、邻苯二甲酸二苯酯（DPHP）10、己二酸二辛酯（DEHA）11、邻苯二甲酸二异辛酯（DIOP）12、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）13、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）14、邻苯二甲酸二异壬酯（DIN

13、P）或邻苯二甲酸二壬酯（DNP）15、邻苯二甲酸二异葵酯（DIDP）,SPE小柱：Welchrom GLASS C8（200mg/6ml，货号：WSS46080602-G）Welchrom GLASS PSA（200mg/6ml，货号：WSS4608PS0602-G）,奶和奶制品中三聚氰胺的测定,制备样品,Welchrom P-SCX小柱配方奶和奶制品中检测三聚氰胺Welchrom P-SCX 60mg/3cc，Cat.No.：WSP020306,活化/平衡：3ml甲醇/3ml水,上样：酸化基液后上样，控制流速,淋洗：3ml水/3ml甲醇一次洗涤,洗脱：3ml5%氨化甲醇洗脱、收集,重新溶解：

14、氮吹至干后，1ml20%MeOH 溶解,奶粉中三聚氰胺,pKa=8,奶和奶制品中三聚氰酸的测定,制备样品,Welchrom P-SAX小柱配方奶和奶制品中检测三聚氰胺Welchrom P-SAX 60mg/3ml，Cat.No.：WSP030306,活化/平衡：3ml甲醇/3ml水,上样：碱化基液后上样，控制流速,淋洗：3ml水/3ml甲醇一次洗涤,洗脱：3ml2%甲酸甲醇洗脱、收集,重新溶解：氮吹至干后，1ml20%MeOH 溶解,奶粉中三聚氰酸,蟾酥药材,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate LP-C18，4.6250mm，5m；检测波长：296nm；流 动

15、相：乙腈：0.5%磷酸二氢钾溶液=58：42；温 度：40度；流 速：1.0ml/min；进 样 量：20l；对 照 品：1、华蟾酥毒基 2、酯蟾酥毒基,对照品,供试品,刺五加浸膏,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate XB-C18 4.6250mm 5m；检测波长：220nm；流 动 相：梯度方法；A：乙腈 B：0.1%的磷酸水溶液 流 速：1.0ml/min；进 样 量：20l；对 照 品：紫丁香苷,供试放大,对照品,供试品,浓缩六味地黄丸马钱苷,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Welchrom C18 4.6250mm，5m；检测波长：23

16、6nm；流 动 相：四氢呋喃-甲醇-乙腈-0.05%磷酸溶液=1:4:8:87；温 度：40度；流 速：1.0ml/min；进 样 量：20l；对 照 品：马钱苷,对照品,供试品,麻黄药材,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate Phenyl-Ether 4.6250mm,5m；检测波长：210nm；流 动 相：甲醇-0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%正丁胺）=1.5：98.5；温 度：室温24 度；流 速：1.0ml/min；进 样 量：10l；对 照 品：1、盐酸麻黄碱 2、盐酸伪麻黄碱,对照品,供试品,他克莫司软膏,仪 器：伍丰LC-100高

17、效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate Diol，5um，4.6250mm；检测波长：225nm；流 动 相：正己烷：正丁基氯：乙腈7：2：1；温 度：室温；流 速：1.7ml/min；进 样 量：5ul；对 照 品：他克莫司,对照品,供试品,贝前列素钠,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate XB-C18，；检测波长：285nm；流 动 相：甲醇-水-冰醋酸=60:40:1；温 度：40 度；流 速：0.7mL/min；进 样 量：20L。要求两者之间分离度大于1.5,4.6150mm，3m分离度=2.33,3.0150mm，3m分离度=1.69,奥美拉唑（Ch

18、.P.）,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Xtimate C8 5um，4.6250mm；检测波长：280nm；流 动 相：10mmol/L 磷酸氢二钠溶液（用磷酸调节pH 值至7.6)-乙腈=70:30；温 度：室温24 度；流 速：1.0ml/min；进 样 量：20l；物质名称：1、奥美拉唑 2、奥美拉唑黄酰化物要求两者之间分离度大于2,有关物质系统实验分离度=3.35,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate LP-C18，4.6300mm，5m；检测波长：280nm；流 动 相：1.4g/L 磷酸氢二钠用磷酸调节pH 到7.6：乙腈=72:

19、28；温 度：30 度；流 速：1.0ml/min；进 样 量：20L物质名称：1、奥美拉唑2、奥美拉唑黄酰化物要求两者之间分离度大于3,奥美拉唑（E.P.）,有关物质系统实验分离度=3.36,复方甘草口服液无水吗啡,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪SPE柱：Welchrom C18E,17%载碳量,200mg/3mL;活化：5ml 甲醇：水=3：1（体积比）平衡：氨水溶液（pH=10，广泛pH试纸测定），测定流出液pH=10时为平衡OK;上样：取无水吗啡对照品0.5 mL（滴加浓氨水2滴，PH10），混匀后过柱，20 mL纯水淋洗。洗脱：5%醋酸溶液洗脱收集。定容至10 mL。进样20

20、L测定分析。样品分析：上样液取0.5 mL滴加浓氨水1滴，混匀后过柱色谱柱：Ultimate XB-C8 4.6mm*150mm，3m流动相：乙腈-0.0025mol/L庚烷磺酸钠-0.05mol/L磷酸二氢钾（5:18:18）流速：0.7 mL/min柱温：室温检测波长：220nm,供试品,对照品,更昔洛韦,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate LP-C18 4.6250mm,5um；检测波长：252nm；流 动 相：甲醇：水=5：95；温 度：室温25 度；流 速：1.0ml/min；进 样 量：20ul；,有关物质供试品分离度=11.54,1.98,利巴韦林

21、原药,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：XtimateTM SUGAR-H 7.8300mm,5um；检测波长：207nm；流 动 相：pH=2.5 硫酸水溶液；温 度：室温21 度；流 速：0.4ml/min；进 样 量：20l；,有关物质供试品,含量供试品,有关物质供试品放大,利培酮片,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：C18；检测波长：275nm；流 动 相：0.5%乙酸铵（用三乙胺调节pH 至7.0）-乙腈=78:22；温 度：室温25 度；流 速：1.5ml/min；进 样 量：10l；,XtimateTM（4.6100mm,3m）,Ultimate

22、XB-C18（4.675mm,3m）,头孢氨苄原药,有关物质系统实验分离度=1.72，1.81,杂质对照分离度=13.52,苯甘氨酸杂质对照,仪 器：伍丰LC-100高效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate AQ-C18，5um，4.6250mm；检测波长：220nm；流 动 相：A 相：0.2mol/L 的磷酸二氢钠（NaOH 调节PH 为5.0），B 相：甲醇；温 度：室温；流 速：1.0ml/min；进 样 量：5l；要求杂质与主峰分离大于1.5,头孢泊肟酯原药,异构体分离度分离度=5.489,有关物质系统实验分离度=2.39,2.38,要求杂质与主峰分离大于1.5,仪 器：伍丰LC-

23、100高效液相色谱仪色 谱 柱：Ultimate XB-C18 4.6150mm，5um；检测波长：240nm；流 动 相：甲醇-水=45：55；温 度：40 度；流 速：1.0ml/min；进 样 量：20l；,维 护,日常维护,正向使用反向冲洗,日常维护,流动相中不含缓冲盐 流动相冲至样品完全流出-90%的有机溶剂冲洗20倍柱体积流动相中有缓冲盐 流动相冲至样品完全流出-过度流动相冲洗20倍柱体积-90%的有机溶剂冲洗20倍柱体积 流动相中有离子对试剂 流动相冲至样品完全流出-过度流动相冲洗20倍柱体积-50%甲醇冲洗20倍柱体积-90%的有机溶剂冲洗20倍柱体积,过渡流动相：有机相和水相

24、的比例和分析流动相中两相比例一致，或者水相比例高于分析流动相，绝对不含缓冲盐。,色谱柱故障,柱压高 柱效低 分离度降低 峰形异常 保留时间变化 柱寿命不理想等,柱压高解决方案,查找原因,系统压力高,是否由色谱柱引起,正常,异常,排除,色谱柱堵塞,在线过滤器堵塞保护柱堵塞筛板堵塞填料变性,柱压高解决方案,堵塞可能原因 外源性杂质 样品或者是流动相中未过滤掉的杂质；内源性的杂质 泵中柱塞杆与密封圈磨损后产生的碎屑；PEEK管老化产生的颗粒；进样阀中密封圈老化产生的杂质；等。,柱压高解决方案,柱压高解决方案,填料变性可能的原因：蛋白类样品累积；强保留物质富集；缓冲盐析出；基质破碎；等解决方案：使用S

25、PE等更加有效的前处理方法；过渡；在pH范围内使用；柱子冲洗；等,伴随 柱效降低 分离度降低 峰形异常,柱压高解决方案,用比你的流动相更强的溶剂冲洗 反相 HPLC(如反相色谱填料RP-18,RP-8等)为了增加强度选择极性小的溶剂 水甲醇乙腈 异丙醇 正相HPLC(如SiO2,NH2,CN,DIOL基色谱填料)为了增加强度选择极性大的溶剂 正己烷二氯甲烷乙酸乙酯 异丙醇乙腈 去除蛋白：乙腈：水：三氟乙酸=50：50：0.1,柱子清洗-强保留物质,柱压高解决方案,柱子清洗-缓冲盐析出：方案1：用过渡流动相以1.0ml/min流速35条件下反向冲洗色谱柱120min；方案2：用过渡流动相以0.2

26、ml/min流速反向冲洗色谱柱过夜。避免缓冲盐析出，因为缓冲盐析出是很难除去的,花费太多的时间用于色谱柱再生而不能保证正常的分析工作是得不偿失的。,柱污染柱外死体积增大流动相成分变化仪器故障键合相流失保护柱污染等,可能原因,解决方案,柱冲洗恢复仪器重新配置流动相排除故障更换新柱更换保护柱芯等,柱效降低解决方案,伴随 分离度降低 峰形异常,常见异常峰形,前延峰；拖尾峰；叉峰（裂峰）；宽峰/馒头峰。,解决方案,样品过载,前拖、后拖或平头峰,T=2.248500ug/ml,T=1.0685ug/ml,前延峰：又称前伸峰、伸舌头峰。前沿平缓，后沿陡峭的不对称色谱峰称前延 峰。参数拖尾因子（T）或对称因

27、子来衡量。解决方案溶剂效应-强溶剂溶解，流动相稀释缓冲作用不适合-增加缓冲仪器系统不匹配-减小系统死体积柱温太低-适当升高柱温的温度 色谱柱损坏(筛板阻塞 和柱头塌陷)-维修色谱柱 色谱柱污染-冲洗色谱柱等,前延峰解决方案,拖尾峰：前沿陡峭，后沿较前沿平缓的不对称峰。参数拖尾因子（T）或对称因子来衡量。解决方案降低pH-抑制硅羟基电合适的缓冲能力-更换缓冲盐增加缓冲作用增加缓冲盐或加大浓度屏蔽硅羟基添加扫尾剂三乙胺色谱柱损坏(筛板阻塞 和柱头塌陷)-维修色谱柱 色谱柱污染-冲洗色谱柱等,拖尾峰解决方案,常见缓冲盐的PH值,缓冲液pKapH范围磷酸盐pK12.11.13.1柠檬酸盐pK13.12

28、.14.1甲酸盐3.82.8 4.8 柠檬酸盐pK24.73.75.7 乙酸盐4.83.85.8 柠檬酸盐pK35.44.46.4 磷酸盐pK27.26.28.2羟甲基甲胺8.37.39.3 氨 9.28.210.2 硼酸盐9.28.210.2 甘氨酸9.88.810.8 1-甲基-哌啶10.39.311.3 四氢化吡咯10.59.511.5 二乙胺10.59.511.5 三乙胺10.79.711.7 磷酸盐pK312.311.313.3,拖尾峰解决方案,峰分叉（裂峰）解决方案,柱污染,不正常,少数进样,多次进样,冲洗,正常,保护柱或分析柱被固体颗粒阻塞,a、取下保护柱再进行分析；b、更换保护

29、柱；c、柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施；d、反向冲洗色谱柱。,峰分叉（裂峰）解决方案,柱头塌陷-更换新柱 基质溶解 装填不当 压力太高 进样溶剂化效应 低浓度进样 流动相溶解样品等,峰分叉（裂峰）解决方案,宽峰/馒头峰,流动相,色谱柱,流速太低,缓冲盐浓度低,色谱柱或保护柱污染,柱头塌陷,色谱柱过载,柱温过低,比例改变,宽峰/馒头峰解决方案,记录仪响应时间太长,色谱柱与检测器间管路不适合,柱外效应,样品池过大,保留时间变化,溶液混合体积变化不一致；高压梯度和低压梯度混合方式差异；系统体积不一致；平衡时间不足够（3-5倍柱体积）；流动相配置精度不一致；对流动相pH值敏感；新旧柱之间老化程度不一致；方法普适性欠佳；柱批次之间的差异；柱变性程度不一致；仪器流速不对；混合器工作不正常；两相比例相差太大（10：90），仪器混合不均匀；等,柱寿命不理想,相同实验之前的柱子寿命较长 柱受过剧烈震动；与之前的柱子品牌不一致；维护方式不正确；样品组成改变；密封圈或者PEEK部件损坏；使用劣质的过滤膜；试剂纯度有变化；等,柱寿命不理想,该实验柱子寿命一直较短 流动相中不溶沉淀物污染；强保留物质污染；流动相的pH超出柱使用范围；样品用强酸或者强碱溶解；错误溶液保存柱子（CN-中性溶剂，苯基-THF）；等,讨 论,