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1、狂犬病的实验室检测与诊断技术,中国生物技术集团公司 武汉生物制品研究所 基因工程室 严家新 徐葛林,1.临床诊断与实验室诊断,实验室手段对狂犬病的确诊非常必要。要求狂犬病病例的统计上报资料要注明诊断的依据（是否包括实验室诊断？）。目前国际上公认狂犬病的死亡率是100%，原则上不承认有狂犬病康复的可能，即狂犬病的发病率应与死亡率相等。没有合格实验室给出的肯定诊断的康复病例应从狂犬病病例的统计数字中剔除。“狂犬病患者必死无疑，不死不算狂犬病”，要挑战这个命题，必须提供确切、完整的病史和权威的实验室诊断资料。,2.人狂犬病的生存期内诊断,生存期内的诊断技术的选择主要随着病程的不同而异。在病后最初几天
2、，检测抗原一般是敏感的。脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后710天出现。检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查狂犬病患者角膜印片或皮肤活组织，但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。皮肤活组织检查常常从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。角膜印片(切勿划痕)取自伴有脑炎的患者，用显微镜的载波片轻轻触及角膜的中心部位。角膜印片及皮肤活组织标本的质量很重要，采取后应立即冷冻，直至检测。不过，用FA技术做生存期内的诊断，其敏感性是有限的。,人狂犬病的生存期内诊断,已证实患者及自然感染和实验感染动物的角膜印片中存在狂犬病抗原。但是，角膜印片检出率较低，阳性结果可肯定是狂犬病，而阴性结果并不能排除
3、是狂犬病的可能。虽然在临床症状开始时，在皮肤活组织中可能检出狂犬病抗原，但早期症状时仅有25-50%的患者为阳性，随着病情的进展阳性率也增加。颈背部皮肤活组织检查只有一些患者呈阳性结果，特别是在临床疾病的早期。用FA检查皮肤活组织的灵敏度一般高于检查角膜印片。,3.动物和人狂犬病的死后诊断,抗原检测病毒分离病毒鉴定等。为了确保实验室结果的可信性，必需满足若干条件：1.标本质量要好；2.标本送达实验室的条件要好（符合GLP标准，获得一定级别的资格认证）；3.获得结果的等待时间要短；4.结果的传递要迅速。,二狂犬病诊断实验室的安全措施,1.危险性 在一般的实验室条件，技术人员暴露于以下传染的危险：
4、野生狂犬病毒(即街毒)，当实验室对接收到的动物标本进行尸体解剖时或对标本进行加工时(悬液制备，离心)等，这一类操作是非常危险的，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。实验室适应的病毒(即固定毒)，当接种实验动物或操作感染的细胞培养时，特别是制备大量的高浓度病毒时，主要的传染来源为手指被有感染的玻璃或工具刺伤或割破；新糜烂的皮肤或粘膜与感染物接触也应认为是一种传染的危险。虽然固定毒的毒力已大为下降，历史上仅有一例死于固定毒操作的报道，但仍有一定的危险性，因此操作固定毒仍须十分小心。,生物安全级别对工作人员的要求(Biological Safety Level,BSL)(Protection,P)
5、BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训，并由有资格的科学工作者指导。BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、有资格的科学工作者监督。BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的科学工作者监督。,2.对安全操作的建议,操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在 P2或P3生物安全实验
6、室内进行。对狂犬病实验室诊断的安全性要求：一个封闭的环境，专作狂犬病感染性工作 通过缓冲更衣间并限制一定的专业人员进入；穿专用的实验室隔离无菌衣和鞋；操作完毕对操作台进行消毒(当材料偶然地溢出时应立即用3的雷苏尔溶液或其他相应的消毒剂消毒)；每日应至少消毒地板一次；所有用后剩余的标本，尸解工具，实验室材料在拿出实验室前应进行高压蒸气消毒。在生物安全柜或隔离器内打开动物颅盖骨的操作很困难，技术人员在操作这项工作时应带面罩，护目镜、手套和围裙。由于与狂犬病相关病毒对人的致病性还不很了解，所有操作可能含有这些病毒的标本均应在生物安全柜内进行。所有实验室工作人员务必进行狂犬病疫苗的暴露前免疫，这些人员
7、的中和抗体应定期检查，所有意外地暴露于感染时必需立即报告负责人。,三 狂犬病毒抗原的检测,1.标本选择 在选择、运送标本前，实际操作获得标本的人员与实验室检测人员事先取得联系共同选择实验方法是很重要的。,1)标本取自个体的生命期,检查病毒和(或)抗原：样品应放在干燥试管内。样品的获取可按下述方法进行。(1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮肤活检等样品。(2)角膜涂片，用显微镜载玻片直接接触角膜操作(不要用棉拭)，标记玻片，空气干燥并用铝锡纸单片包裹。检测抗体：血液、CSF或血清采集于干燥试管内，并低温冰冻存放。,2)标本取自死亡后的个体,送至实验室标本的方式依动物种类不同而
8、不同。(1)小的野生动物(包括蝙蝠)送完整的个体以便对动物品种进行准确鉴定。(2)家养食肉动物(狗、猫)或野生食肉动物(狐狸、貉、浣熊、臭鼬、豺等)仅送头部。(3)更大的动物(家养或野生食草动物)打开头盖骨并取脑送至实验室。,标本取自死亡后的个体（人）,对人狂犬病在有可能进行全面尸解时，把整个脑取出，或选择一些部位切下(海马角、脑干、皮质、小脑)送至实验室。在特殊情况下(困难的野外条件，动物流行病学检测)以及因宗教或传统原因对狂犬病人无法尸解时，可以用塑料管或吸管穿进枕骨孔或眼窝后取出一些脑组织)。,2.标本的运送,标本运送必需严格遵循安全要求，包装务必要有保证。1)可靠的诊断要有一个保存良好
9、的标本；2)运送狂犬病标本的服务人员应事先进行过抗狂犬病免疫并证明已得到完全的保护。3)小动物的躯体或较大动物切下的头部标本可用10甲醛溶液处理过的材料包裹，然后放入一个厚塑料袋内扎紧。如仅取脑(大动物)则应把脑放人一个坚固的塑料或金属容器内并密封，标本作好标记，外加第二层包装并放人泡沫塑料盒中。远距离运送时可用干冰保冷。泡沫塑料盒用牢固的粘性带仔细封固；把全部有关标本的资料放在信封内固定在盒上，再装进一个纸板箱内。箱上应清楚地标明“小心，有感染性生物材料，狂犬病诊断用生物学标本”字样。当无冷冻条件且标本较小时，可以将小块脑组织放进装有80甘油缓冲液的小瓶内，以保存其感染性。在无需保存标本的感
10、染性，准备用免疫荧光法检测抗原时，则可将脑组织标本用10甲醛固定(固定液内应含有苦味酸)。,3.标本的获取,1)动物脑组织的获取 1)将动物头部放在解剖台上用骨固定钳于上颁骨处牢牢固定住，用锋利的屠刀从眼部至颅骨底部作一中线切割。然后将颞肌从颅部切除，颅盖骨用割刀和锤子等工具割掉。对大动物可用一外科骨锯在眼部二侧上方将头盖骨横切，切除脑膜，将髓质和脑神经切割后，即可将脑取出放在一纸盘或大平皿内。,动物脑组织的获取,2)特异性病毒包涵体在脑的一些部位更丰富，特别是海马回，为了暴露海马回，从一脑半球背面约半球间沟外侧2cm处往下通过灰质和白质直到侧脑室作一纵切。海马角像一半园柱形闪光体从脑室底部凸
11、出，小脑和脑干也富有病毒包涵体。当标本保存不好时，通常脑干，髓质和视神经还能保持完好。在常规的操作中，采集海马角、一小块脑干和一小块皮质放在平皿内，在底部和上面标上标本的序号。平皿立即放置于通风柜内处理或保存在4冷柜内。,2)唾液腺的获取,为取出颌下腺，在复盖于下颌骨间的皮肤上作一切割，将皮肤往外侧翻，两侧的颌下腺位于颌骨后部边缘表面。在下颌下淋巴结的后面（这二种不要相混淆）。,4.标本的快速收集技术,在某些情况下可能难于或不可能尸解以便打开颅骨取脑,为减少这些困难已经设计出简便的技术，即用塑料管插入颅骨采集一小块脑组织体。第一种技术是用吸管通过枕骨孔插入并往前推至一眼睛部位，则吸管中的脑组织
12、内含有部分脑干，小脑，海马回和皮质。第二种技术为将吸管通过眼窝后壁(用套管穿孔)并推至枕部，脑组织内含有部分皮质、海马回、小脑。,1)材料,取样试管、塑料或玻璃吸管、套管。保存或运送溶液：80甘油 PBS。,2)方法,(1)枕部途径：把动物颈部往前弯曲，切开枕部和第一颈椎间的皮肤和肌肉；割开寰椎一枕部韧带，打开关节；将取样管通过枕孔插入并推向一只眼，拔出吸管，里面含有脑组织柱状体。(2)后眼框途径：将眼球推向一边，用套管在眼窝后壁穿孔；将取样管插人推向颅骨后部对侧拔出，吸管内即含有脑组织柱状体。(3)脑柱体的收集：用合适的棉拭子或用橡皮球从管于的清净端吹气将脑柱体从管子内推在平皿内；如试验诊断
13、需延期进行则将脑柱体放进装有甘油溶液的螺旋盖小瓶中。,5.荧光抗体实验 Fluorescent Antibody Test(FAT),该方法的特点是：耗时短，整个FAT操作需30分钟，若加上涂片、固定，则需2-4小时。与小鼠颅内接种试验MIT相比，符合率达99%。需荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体。,狂犬病毒抗原,荧光标记抗狂犬病毒抗体,免疫荧光实验检测狂犬病毒抗原,荧光抗体实验检测狂犬病毒抗原,FAT的技术要求：由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处，因此合适的取样部位对抗原的检测很重要。脑样品印片必须用丙酮固定5-10分钟，因为丙酮可去除细胞膜表面的脂类，以便抗体到达细胞内与狂犬病毒结合
14、。脑样品必须保存在含50%甘油的生理盐水中，印片染色前需用生理盐水洗涤数次。荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。,荧光抗体实验检测狂犬病毒抗原,操作要求：印片不能太厚，否则易出现假阳性一个切面最多可印4次，否则易出现假阴性丙酮固定时间不宜太长洗涤不宜过度判读结果应快速，以免荧光淬灭,用抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体制备荧光结合物,我室目前采用抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体制备荧光结合物，经法国巴斯德研究所多次实验，分别检测了人、犬、猫、狐狸、臭鼬、蝙蝠等动物来源的样品，证实我们的荧光抗体具有非特异性小、灵敏度高的特点，质量上不比法国的产品差。我们用该
15、方法检测了我国广西狗肉市场上出售的食用狗的脑组织，结果发现在154份外观健康的犬中，有5份为狂犬病毒抗原阳性，并且通过乳鼠颅内接种，我们已分离到这5株狂犬病街毒株。,6.快速狂犬病酶免疫诊断法 Rapid Rabies Enzyme Immunodetection(RREID,抗狂犬病毒单抗,狂犬病毒样品,酶标抗狂犬病毒抗体,6.快速狂犬病酶免疫诊断法,技术特点：本试剂盒操作方便、快速灵敏，适于大量样本的检测。本试剂盒中酶标板包被后需立即使用或保存于-20C备用。肉眼观察：阳性对照显黄颜色，阴性对照完全无色。所有显黄色样品，无论深浅均认为是阳性。这种肉眼观察已足够作出诊断，非常经济，因为不需要
16、昂贵的酶标仪，也最适合于作现场流行病学调查。酶标仪读数：仔细擦净平板底面，用450nm滤光片读数。阳性对照光密度值（OD）必须大于1.0单位，阴性对照OD值须低于0.1单位，判定值（CUT OFF）的确定：阴性对照OD值 0.008。OD值等于或大于CUT OFF的标本均视为阳性。福尔马林固定的样品不适宜作RREID。,7.各种抗原检测方法的比较：,直接荧光抗体试验（FAT）:最大优点是快速、费用低且敏感性和特异性高。快速狂犬病酶免疫诊断（RREID）试验:也是一种快速的诊断方法，有非常好的敏感性和特异性；与 FAT一样，即使标本的运输条件不太好，也不会过多影响结果。RREID也与脑标本快速收
17、集方法相适应。细胞培养感染试验(RTCIT）:成神经细胞瘤细胞对非常敏感和特异。能在24小时以内得出结果，可替代小鼠分离病毒的方法。但此法只适合在装备较好、工作人员受过较好训练的实验室中进行。,四 狂犬病毒的分离和滴度测定,1.小鼠颅内接种分离狂犬病毒法（MIT）：该方法敏感，适于不具备组织培养条件的实验室分离狂犬病毒街毒。耗时较长，仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病毒，需配合免疫荧光法作特异性鉴定。,小鼠颅内接种分离狂犬病毒法,4-6只小白鼠(9-11g重),样品，0.03ml/只,4天后观察小鼠发病情况,细胞培养分离技术Cell-culture Isolation Techniques(C
18、IT),该方法敏感，配合免疫荧光法可进行特异性快速诊断。需在具备组织培养条件的实验室中进行。,狂犬病毒抗原的检测与诊断,30%脑悬液样品，5000rmp，30min,N2a细胞，继续培养24h后固定，加荧光标记的抗狂犬病毒核蛋白抗体,细胞无荧光，表明样品中不含狂犬病毒,细胞有荧光，表明样品中含有狂犬病毒,胶体金免疫层析法检测狂犬病毒抗原,试纸有效性标志,狂犬病毒阳性标志,胶体金垫,样品插入端,3.组织培养狂犬病毒快速滴定法,待测RV样品经系列稀释后，分别感染96孔细胞培养板中的BSR细胞。该细胞在感染RV后会在细胞质内形成大量包涵体，其主要成分为RV的NP。感染24小时后，经抗RV NP荧光标
19、记抗体特异性染色，可在荧光显微镜下观察到荧光灶（FF,Fluorescence Focus）。通常在低倍显微镜(160X)下检查8个视野。滴度用 Reed&Muench 方法计算，用荧光灶单位(FFU/ml),2)结果,我们将同一份CVS毒种分装保存于一70，在半年时间内重复测定6次，其滴度相当稳定（对于病毒稀释度1：103.5，t=0.445，P0.05；对于病毒稀释度1：104.2，t=0.353，P0.05）。此CVS毒种在小鼠中的毒力滴度为5.5 LogLD50/ml(Sm=0.4 Log LD50/ml),可用作毒力参考标准品。根据未知RV样品与此参考样品在组织培养中用荧光灶单位(F
20、FU/ml)表示的滴度的比值，可直接换算出其在小鼠中的LD50滴度。,狂犬病毒抗原检测方法的比较,诊断技术 免疫荧光 快速酶 小鼠颅内 细胞培养 胶体金 实验 免疫诊断 接种 分离技术 免疫层析法所需时间 2-3h 3-4h 5-10d 20-24h 5-10min特异性 99.99%99.96%ND 99.99%ND敏感性 99.99%98.06%ND 98.21%ND,狂犬病毒抗原的检测与诊断,多种方法对广西狗肉市场狂犬病街毒检测结果样品例数 MIT RREID IFA PCR（狗脑）阳性数 阳性数 阳性数 阳性数 102 4*4 4 4*3份为狂躁型，1份为麻痹型,五 灭活疫苗效价的测定
21、,1.改良抗体结合试验(ABT)在体外快速检测灭活狂犬病疫苗效力 基本原理：将定量的RV中和抗体与系列稀释的灭活狂犬病疫苗在试管中进行抗原抗体反应，疫苗中的有效抗原成分会与相应中和抗体结合，即消耗掉部分(或全部)中和抗体。然后将剩余的中和抗体用 RFFIT方法在细胞培养中进行快速测定。疫苗中的有效抗原成分含量越高，剩余的中和抗体的含量越低；经与已知效力的疫苗标准品所作的对照进行比较，即可推算出待测疫苗的效价。,改良抗体结合试验(ABT)在体外快速检测灭活狂犬病疫苗效力,实例：我们对6批灭活狂犬病疫苗用ABT方法测定4次，并与用NIH试验的结果进行比较，两种方法所得结果的差别均无显着意义(t1.
22、39,P0.05)，即这两种方法的结果基本相符。ABT 与NIH 效力试验的结果有很好的相关性，而且更加快速、经济，重复性更好。该方法在大多数情况下可取代 NIH 效力试验。,改良抗体结合试验(ABT)的应用,改良ABT 相对于 NIH 试验有许多明显的优点,在德国等国已作为常规方法，在狂犬病疫苗的生产和科研中已普遍使用了约二十年，基本取代了NIH 效力试验。此方法已载入WHO 1996年版的狂犬病实验室技术手册（第四版）。WHO推荐将此方法用于疫苗生产过程的质量控制。不过在欧洲药典2000年版中，此方法仅是推荐用于RV糖蛋白浓度检测的方法之一。当然RV糖蛋白浓度与疫苗的效力直接相关。,2.简
23、化的NIH小鼠试验法,简化的NIH小鼠试验法原则上与传统的NIH法没有区别。此方法的核心:将常规的测定三个稀释度简化为一个稀释度，而且此稀释度只用10只小鼠。此方法的关键:正确选定稀释度。此稀释度应为假定该疫苗刚好达到2.5 IU/剂的最低合格要求时的50终点稀释度(即ED50,又称50%有效剂量)。按此稀释度接种10只小鼠，以有8只小鼠存活（得到保护）为合格标准。,稀释度计算公式,此稀释度可由以下公式计算决定：D=Dm+log10(n)-log10(N)log10(v)其中，D待测疫苗的最小ED50（用常用对数表示）。Dm参考品疫苗的平均ED50（用常用对数表示）。n 待测疫苗效力的最低合格
24、要求（IU/ml）。N 参考品疫苗的效力（IU/ml）。v=单剂待测疫苗的体积(ml)国外文献上通常采用上述公式。如参照国内规程上的表述方式（不用对数），则上式可改写为更直观的形式：D=(Dm n)(N v),稀释度计算举例：,某参考品疫苗的效力N=2 IU/ml，其ED50平均值是16倍稀释，用常用对数表示为1.2，即Dm=1.2；单剂待测疫苗体积v=2 ml,对其效力的最低合格要求是2.5 IU/剂，因此n=2.5IU/2ml=1.25 IU/ml。按公式计算：D=1.2+log10(1.25)-log10(2)log10(2)=0.7 100.7=5 即ED50 为5倍稀释。如不用对数而
25、直接计算，结果也相同：D=(161.25)(22)=5。将待测疫苗按1:5稀释接种10只小鼠，实验结果如有8只以上的小鼠存活，则表明该待测疫苗的效力大于1.25 IU/ml x 2ml=2.5 IU，即肯定该待测疫苗达到最低合格要求。,五狂犬病毒核酸的检测,1直接检测法：用已知的互补于选定的基因区的一小段核酸序列作探针，进行直接分子杂交检测目的基因是否存在。2间接检测法：在进行分子杂交检测目的基因是否存在以前，事先对目的基因进行扩增，再作分子杂交检测。由于狂犬病毒的转录和复制产生的是RNA，所以扩增的第一步必须将病毒的RNA进行逆转录，成为互补链DNA，然后再将该DNA用多聚酶链反应(PCR)
26、进行扩增。,1.基因扩增(PCR)及检测,PCR技术于1990年首次用于检测狂犬病毒RNA，近几年来狂犬病毒分子流行病学研究的进展都与该技术的应用有关。对原始样品中的微量病毒RNA经逆转录(RT)产生cDNA后，再经PCR进行放大。对放大产物可根据诊断或分型的不同需要分别用不同方法进行分析，如凝胶电泳、斑点杂交、限制性片段长度分析(RFLP)、直接测序等。与传统的病毒分离或免疫学检测法相比，PCR在敏感性、特异性、特别是在能提供精确的序列资料等方面都要优越得多，因此有希望更广泛地用于狂犬病的常规检测及分子流行病学研究。,PCR产物的琼脂糖凝胶电流电泳图谱,RV PCR的目标基因,在选择RV基因
27、组中的目标基因时，为诊断的目的应选基因组上的保守区。为分型及鉴别变异株应选易变区。N基因:高度保守且大量转录，适用于常规检测，可检出大样品中含量很低的多种狂犬病毒。L基因:其内的若干区段也极稳定，但转录量较低，需采用特别敏感的检测方法。G和 L基因间的间隔序列又称伪基因:是进化上某个蛋白编码基因的残迹。它最易发生突变，更能代表病毒的自然进化，是最好的进化“时钟”。对伪基因的比较特别适用于区分亲缘关系相近的毒株。G蛋白:是诱生中和抗体的主要抗原且不如N蛋白稳定。N蛋白虽不能诱生中和抗体，但与免疫保护反应也有一定关系。为了解不同毒株的抗原特性和交叉保护的分子基础，常需要对G基因和N基因进行序列比较
28、分析。,2.以基因扩增对狂犬病毒进行分型和来源鉴定,以PCR为基础的一种简便实用的狂犬病毒分型方法是限制性片段长度多形性分析(RFLP)。例如，用3种限制性内切酶即能方便地鉴别基因1、4、5和6型：一套引物可使样品中N基因的PCR产物为长约15Kb的片段，对产物分别用3种限制酶消化：1)只有Pst I选择性地切割6型(1个切点)；2)只有4型不被PvuI切割(其余均为1个切点)；3)DdeI可将1型切成2段，将5型切成多段。另一套覆盖G-L的引物可经PCR放大在狂犬病毒及相关病毒中最多变的伪基因，可用于对关系极近及极远的毒株定型。对放大产物用5种限制酶可区分6种主要疫苗株(PV、ERA、SAD
29、B9、HEP、CVS和PM株)，并可与当前流行的野毒株作比较。若用免疫学方法，需用8种抗N和 6种抗G单抗才能完成同样的鉴别任务。,狂犬病的潜伏期到底能有多长？PCR技术应用于狂犬病毒来源鉴定的一个精彩例证：,美国CDC的Smith等对从美国3名狂犬病死者分离的毒株的鉴定。死者均为移民，其一移民时间已达6年。由于在美国感染狂犬病的机会极少，而且PCR序列分析的结果直接证明分离株分别与死者来源国家的狗中流行的毒株相同，所以该作者以迄今最令人信服的方式证明了狂犬病的潜伏期可长达6年以上。,3.狂犬病毒G基因的序列测定和系统树进化分析,1981年Anilionist等报道了狂犬病毒G基因序列，随后几
30、年里，又对几株狂犬病毒部分的或全部的基因进行测定。由此，通过序列分析，对各毒株之间的相互关系有了进一步了解，明确了狂犬病毒分类的分子基础。逐渐将狂犬病毒的核酸、氨基酸序列与已知的生物学和免疫学的特性联系起来。可以推测或确定病毒的抗原决定簇，和病毒致病力有关的分子基础，以及病毒感染、复制和变异等的重要功能性氨基酸区域。这对研制狂犬病毒新型疫苗和抑制狂犬病毒感染和复制有着重要的指导作用，从而更有利于对狂犬病毒的预防和和亚洲不同地区、不同来源的RV街毒株的基因的全序列，确定决定其毒力、免疫原性和致病性的主要功能区，进行了序列的系统进化比较分析，探讨我国及周连地区RV的遗传变异规律。,我所与法国巴斯德
31、研究所一项合作研究的实例：,(1)RT-PCR及测序引物 参考文献和PV株序列，并用Oligo4.0软件进行校验，最后选取的引物为：N（55-73）5 ATG-TAA-CAC-CTC-TAC-AAT-GG 3PA(3000-3019)5 TGG-TGT-ATC-AAC-ATG-RAY-TC 3PB(4077-4096)5 ACC-CAT-GTY-CCR-TCC-ATA-AG 3 PC(3894-3913)5 GAT-TAC-ACY-ATY-TGG-ATG-CC 3PD(5516-5536)5 GAG-TTN-AGR-TTG-TAR-TCA-GAG 3P1 5 CTC-ATG-TGA-ACG-G
32、GG-TGT 3,(2)病毒RNA的提取及RT-PCR,于四日龄乳鼠脑内接种狂犬病病毒，注射量为0.02ml/只。待小鼠出现明显症状时，取脑进行荧光抗体检测（IFA）。对阳性鼠脑，采用TRIzol Reagent(GIBCOBRL)提取总RNA。用N与PC为引物，采用AMV Reverse Transcriptase(Promega)逆转录合成cDNA。在0.5 ml Ep管中依次加入35.5 l灭菌水、1l dNTP、5 l 10Buffer、3 l MgCl2、1 l PA(1ul PC)、1 l PB(1ul PD)、1 l cDNA，短暂离心后100水浴1 min，再加入0.5 l D
33、NA聚合酶，50 l液体石蜡，短暂离心后置于PCR仪：经94 1min，58 50 s，72 90 s共循环40次，72保温10 min后冷却至4。10000 r/min离心5 min后取下层水相转入1.5 ml Ep管，取5 l用于电泳鉴定，余下的-20保存用于纯化。,(3)产物纯化 采用Wizaed PCR Preps DNA Purification System(Promega)纯化PCR产物。(4)电泳鉴定、cDNA序列测定 取5 l未纯化产物或1 l纯化产物进行1.2%琼脂糖电泳。测序由大连宝生物有限公司完成。(5)序列分析 序列的比较排序采用CLUSTER以及GENEDOC软件处
34、理。,聚类分析(进化系统树的构建),2)结果和讨论：,用计算机分析四株病毒糖蛋白基因（G基因）开放读码框架（ORF），四株病毒G基因编码区均从起始密码ATG开始，除终止密码广西-4株为TAA外均为TGA，从ATG到终止密码全长共1575个核苷酸残基。(1)与其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性的比较(2)狂犬病毒G基因不同区段比较(3)疫苗的评价(4)聚类分析(进化系统树的构建),五、狂犬病毒抗体的检测,WHO狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5 IU/ml的抗体水平表示能得到有效的保护。1992年第八届WHO狂犬病专家委员会肯定并推荐将小鼠中和试验(MNT)和RFFIT作为检测RV中和抗体的
35、两项基本方法，这两种方法应作为其它方法的基准和参考。MNT是从上世纪30年代就开始采用的经典方法。自上世纪70年代初开始，RFFIT逐渐成为国际上最广泛接受的对MNT的替代方法。WHO专家委员会建议在可能时尽量用RFFIT代替MNT，因前者更快速、价廉，且灵敏度与MNT相同。,小鼠中和试验（Mouseneutralizing test,MNT）,原理：将一定量预先滴定好的攻击病毒，与待滴定的系列稀释血清孵育。试验中需设已知滴度的参照血清。然后将病毒/血清混和物经脑内注射初成年小白鼠，计算死亡率和保护50%动物的血清稀释度。特点：可定量检测狂犬病毒中和抗体效价。需专门技术培训，操作较繁琐。需14
36、天出结果，耗时长，不利于快速诊断。需较多试验小鼠，成本高。动物间的个体差会影响试验结果。,小鼠中和试验,三倍系列稀释待测血清 预先滴定过的中和用狂犬病毒（设已知国际单位的标准血清对照）CVS鼠脑悬液（稀释成30-300LD50）等量混合 37保温1小时后 37中和1小时 重复滴定LD50 颅内接种10-12克小白鼠 观察并记录小鼠发病及死亡情况 根据试验结果计算中和指数及中和抗体含量,2.快速荧光灶抑制试验（RFFIT）Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,基本实验过程：将固定剂量的CVS病毒与系列稀释的待测血清(包括已知滴度的参考血清)一起在96孔细
37、胞培养板中温育(体外中和反应)。病毒的最适剂量在预实验中预先确定，为经24小时温育后能使80%的细胞感染(产生荧光包含体)的最高稀释度。中和反应结束后在每孔中加入等量敏感细胞(BSR)悬液。再经24小时温育后,细胞单层用丙酮固定,用荧光标记的抗NP抗体染色,以检测未被中和的病毒的存在(荧光灶FFU)。与病毒对照组比较,计算每种待测血清使固定量CVS病毒的FFU/ml 减少50%的稀释度，然后与已知滴度的参考血清比较，计算每种待测血清的中和抗体滴度。,快速荧光灶抑制试验,三倍系列稀释待测血清 预先滴定过的中和用狂犬病毒（设已知国际单位的标准血清对照）CVS病毒悬液（稀释成30-100FFD50）
38、等量混合 37保温1小时后 37中和1小时 复滴定TCID50 接种96孔已形成单层的BSR细胞 CO2孵箱37培养24小时 固定并用荧光抗体染色，荧光镜观察，记录每孔荧光灶数量，计算血清抗体效价,病毒最适攻击量的确定：24小时能使80%细胞被感染的最高稀释度。,MNT和RFFIT检测RV中和抗体含量的变异范围：MNT：67%149%RFFIT：68%146%,MNT和RFFIT检测2种抗RV血清参考品的结果,参考品 RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）A 13.4 14.0 20.2 19.5 12.7 13.9 15.5 18.0（GMT）15.2 16.2 B 40.5 52.2
39、 70.0 42.2 52.3 60.0 66.2 47.3（GMT）56.0 50.0,微量RFFIT方法的建立,我所在八年前已开始建立起微量RFFIT方法，并对该方法的重复性、特异性和灵敏度与MNT进行了比较，共检测了数百份人畜血清样品。该方法有希望在狂犬病的临床诊断、疫苗质量控制和流行病学调查等项工作中获得广泛应用。,A.实验方法,1)攻击病毒的制备和滴定：(1)通常采用的毒株为固定的狂犬病毒CVS株,在BHK/BSR细胞中制备。(2)细胞上清分装安瓶,储存在-80。(3)最适攻击剂量为24小时温育后能使80%的细胞感染(产生荧光包含体)的最高病毒稀释度(预试验确定，参见前述组织培养狂犬
40、病毒快速滴定法)。,2)血清病毒中和反应：,(1)待检血清经56 30分钟灭活。(2)在96 孔板上设置“未感染细胞对照”和“病毒对照”孔。(3)每个血清稀释度设2个孔。(4)除病毒对照孔外,每个孔加入100l D-MEM 培养基。(5)直接在孔中进行待检血清和参考血清的系列3倍稀释:(每孔已加入100l 培养基)将50l血清加入第一排孔,依次从1/3 到1/81 稀释。在“病毒对照”孔,加入100l培养基。(6)在含稀释血清的每个孔内,加入50l预先滴定的病毒悬液。在“未感染细胞对照”孔内,加入50l培养基。在“病毒对照孔”,对病毒悬液进行4次2倍稀释,从1/2 到1/16。(7)在375%
41、恒湿温箱中保温1小时。,3)加入细胞：,(1)用胰酶消化细胞,制备浓度为1x106细胞/ml的细胞悬液.每孔加入50l细胞悬液(5x104 细胞)。(2)在375%CO2 恒湿温箱中温育24小时。,4)固定和染色：(1)用与盛有漂白粉溶液的大瓶相连的真空装置抽吸去各孔中的上清液。(2)用PBS 浸泡各孔3次,每次5分钟(抽吸上清液)。(3)以80%丙酮浸洗各孔,重复一次(在-20C放置5分钟)。抽干各孔,空气干燥。(4)每孔加入40l抗NP 抗体荧光结合物(预先1:20)稀释),在37C 湿盒中保温30 分钟。(5)吸出结合物,以PBS 洗2次，第一次1分钟,第二次5分钟。(6)空气干燥,每孔
42、加1 滴甘油。(7)萤光显微镜下观察。,B.结果观察,1)记录每孔的萤光数(FF)。2)与病毒对照组比较,对每种待测血清计算FF数减少50%的稀释度。3)与参考血清比较,计算每种待测血清的滴度。,C.计算实例:,血清X 1/27:15%参考血清:10 IU/ml 1/81:20%1/81:60%1/243:70%(50-15)/(60-15)xLog3+Log 27(50-20)/(70-20)xLog3+Log 81=0.371+1.4314=1.80=0.286+1.9=2.194 101.8=63 102.194=156.5 X/10=63/156.5 X=4.03 IU/ml,用MNT
43、和RFFIT测定2种抗RV中和血清参考品的结果,参考品 RFFIT(IU/ml)MNT(IU/ml）A 13.4 14.0 20.2 19.5 12.7 13.9 15.5 18.0（GMT）15.2 16.2 B 40.5 52.2 70.0 42.2 52.3 60.0 66.2 47.3（GMT）56.0 50.0,RFFIT的特点：,可定量检测狂犬病毒中和抗体效价。耗时较短，可用于精确定量的快速诊断。重复性好。需专门技术培训，操作较繁琐。需荧光显微镜。,3.酶免疫吸附法（ELISA）：,酶免疫吸附法是七十年代建立的方法，目前世界上用于检测狂犬病毒抗体的酶免疫法基本上是采用间接ELISA
44、法，其吸附抗原有全病毒颗粒、纯化的狂犬病毒糖蛋白以及纯化的狂犬病毒核衣壳蛋白（RNP），并以过氧化物酶标记的抗抗体作为标记抗体，即可检测人及不同动物血清中的抗狂犬病毒抗体。,各种检测狂犬病毒抗体的ELISA法的抗原抗体比较,酶免疫吸附法,抗狂犬病毒单抗包被,狂犬病毒抗原,待检人血清中的抗狂犬病毒抗体,酶标抗人IgG抗体,显色底物,ELISA的特点：,ELISA只需简单的实验室设备，尤其适合检测大量的血清样品，且在很短的时间内即可出结果。ELISA法与MNT有较好的相关性，在小鼠饲养及组织培养不具备的实验室里，ELISA可视为MNT的替代方法。严格地讲，ELISA实验并没有测定真正的中和抗体，所
45、测抗体为几乎所有的与包被板上抗原结合的IgG抗体，包括一些非特异性抗体，所以其结果不用国际单位（IU/ml）表示，而是用等价单位（EU/ml）表示。,EIA与MNA检测狂犬病毒抗体结果比较免疫用疫苗 例数 MNA EIA EIA 阳性数 阳性数 阳检率 维尔博苗 74 74 74 100%aG浓缩苗 67 67 62 92.5%CTN精制苗 34/31/,4.其他检测抗体的方法：,1）斑点免疫结合法（DIA）：1986年由Heberling等建立，用于检测人血清中狂犬病毒抗体，其结果与RFFIT具有可比性，但须稍作改进以检测狂犬病毒中和抗体水平。该方法只需一滴血、仅30-40分钟即可出结果。,
46、2）快速凝集法（RAT）：,以抗原致敏乳胶，可检测2.5IU/ml以上的抗体水平,RAT与MNT符合率达97%以上。,3）间接免疫荧光法（IFA）：,以狂犬病毒感染细胞，制成细胞片，用间接免疫荧光法检测人血清中狂犬病毒抗体，但该方法只能作半定量测定抗狂犬病毒抗体，其灵敏度随待测血清的稀释度增加而降低，同时与细胞片制备过程中病毒接种的量及感染时间长短有关。,各血清学试验获得结果所需时间,方法 MNTRFFITELISA IFA时间21天26小时 4小时 2小时定性或定量定量定量定量 定性,六实验室检测技术发展的趋势：尽量少用或不用动物,RV的传统的检测方法是小鼠动物试验。在中国生物制品规程200
47、0年版中，规定的狂犬病疫苗的多项检定均采用小鼠动物实验，如病毒滴定、病毒灭活确证试验以及疫苗效力测定等。这些实验都需要大量动物，实验费用高，操作繁琐，而且每次实验需时14天以上，其中测定疫苗效力的实验甚至需要至少28天。由于影响动物实验结果的因素很多，如动物的品系、饲养条件，实验人员的操作水平等，所以实验结果的误差较大、重复性较低。,细胞培养法相对于小鼠动物试验的优点,廉价：一个细胞培养孔可取代一组小鼠，实验费用可显著降低。快速：全部实验所需时间能降至2个工作日。简便、重复性高：由于细胞培养是在96孔细胞培养板中的无菌条件下进行，实验条件规范，各种试剂定量的精确性能得到保证，对实验人员的操作水
48、平的要求较易满足，因而所得实验结果有更高的一致性。灵敏度：与小鼠动物试验基本相同。避免使用动物。在欧洲药典2000年版中，相应的检定绝大多数均由细胞培养法所取代。,保护动物、善待动物,采用细胞培养取代小鼠动物试验，也符合保护动物这一国际流行趋势。保护动物、善待动物是一个国家或社会文明进步程度的标志之一。许多发达国家都已有明确的有关保护动物的立法，例如在欧洲已颁布 保护用于科学和其它试验目的的脊椎动物公约 要求在同时有其它实验方法可用时，尽量不用实验动物；在没有其他替代方法时，也应尽量减少动物的用量。随着中国改革开放的深入，我国在科研动物的使用方面也应逐步与国际接轨，今后尽量减少动物用量已是大势所趋。,在我国推广应用细胞培养法的限制因素是此方法相对于小鼠动物试验在基础设施方面有较高的要求，主要是要有细胞培养的全套设施和荧光显微镜。建立此方法的另一前提条件是有质优价廉的关键试剂：抗 RV NP 荧光标记抗体。目前我所已能批量生产这种关键试剂。随着基础设施的不断改善，目前国内大多数疫苗生产单位均已经有条件逐步采用细胞培养法以替代小鼠动物试验法。,结语,各种传统的和新型的体外检测技术，如免疫扩散、免疫沉淀、荧光抗体、酶标（ELISA）、PCR、序列测定等，通过在实践中不断完善和规范化，都有可能分别或协同满足未来的检测工作的不同需要。,
