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1、长链非编码RNANORAD在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖能力的影响王靖L杨利杰，宋政，王瑞宇，张钱璐，李俊大理大学临床医学院，云南省大理市671000【摘要】目的研究长链非编码RNADNA损伤诱导的非编码RNA(NoRAD)在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖的影响。方法RNA-Seq分析肺癌组织中LnCRNA及miRNA的表达改变，根据表达量确定候选LnCRNA；RT-qPCR检测分析肺癌组织及肺癌细胞中候选NORAD的表达；免疫荧光检测分析肺癌组织中细胞增殖核抗原Ki-67的表达；通过直线回归分析肺癌组织中NORAD与Ki-67的表达相关性。生物在线软件联合miRNA测序结果，并通过荧光素酶
2、检测分析NORAD与miR-26b-5pmiR-654-5p结合可能性。将A549细胞分成空白对照组(ContrO1)、si-NORAD组、miR-26b-5pmimics、miR-654-5pmimics、si-NORAD与miR-26b-5pmimics联合组、si-NORAD与miR-654-5pmimics联合组，利用脂质体法将si-NORAD组、miR-26b-5pmimics、miR-654-5pmimics分别或联合转染入A549细胞，24h后，利用EdU检测细胞增殖能力、ArmeXinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡、蛋白印迹(WeStemblot)检测细胞凋亡相关蛋白(Ba
3、d、Bd-2、CIeaVedCaSPaSe-3)的表达。结果NoRAD在肺癌组织及肺癌细胞中的表达均显著升高(均P0.01),其表达量与Ki-67的表达呈正相关(r=0.646,PmiR-654-5p在肺癌组织及细胞中的表达均显著降低(均PV0.01),生物在线软件及荧光素酶检测验证，NORAD与miR-26b-5p、miR-654-5p存在结合位点；在肺癌组织中，miR-26b-5p(r=-0.403,P=O.000)、miR-654-5p(r=-0.423,P=0.000)的表达与Ki-67的表达均呈负相关；miR-26b-5p(=-0.435,PV0.05)与miR-654-5p(r=-
4、0.395,P0.05)的表达与NoRAD表达均呈负相关。与ComroI组比较，si-NORAD可显著抑制A549细胞的增殖(PV0.01)、促进其凋亡(PVO.01),Bad及CleaVedCaSPaSe-3的表达均显著升高(均PVO.01),Bd2的表达显著降低(PV0.05)；与Si-NoRAD组比较,Si-NoRAD与miR-26b-5pmimics联合组、si-NORAD与miR-654-5pmimics联合组可进一步抑制细胞增殖(PV0.01),促进细胞凋亡(PVO.01),Bad及CIeaVedcaspase-3的表达均显著提高(均P0.05),Bcl-2的表达显著降低(PV0.
5、05)。结论肺癌中NORAD的表达显著上调，可能通过抑制miR-26b-5p.miR-654-5p的表达而促进肺癌细胞增殖，NORAD可能作为肺癌的诊断标志物。*基金项目：大理大学博士科研启动基金项目(NoiKYBS)通讯作者：王靖,E-mail：【关键词】肺癌；长链非编码RNA；细胞增殖；微小RNAExpressionoflongnon-codingRNANORADinlungcanceranditseffectonlungcancercellproliferation.WANGJing,YANGLi-jie,SONGZheng,WANGRui-yu,ZHANGYu-l,LlJun.Clin
6、icMedicalCollege,DaliUniversity,Dali671000,Yunnan,CHINA(AbstractObjectiveToinvestigatetheexpressionoflongnon-codingRNADNAdamageinducednon-codingRNA(NORAD)inlungcanceranditseffectontheproliferationoflungcancercells.MethodsTheexpressionchangesofLncRNAandmiRNAinlungcancertissueswereanalyzedbyRNA-seq,an
7、dcandidateLncRNAwereidentifiedaccordingtotheexpressionlevels.RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofcandidateNORADinlungcancertissuesandlungcancercells.ImmunofluorescenceassaywasusedtodetecttheexpressionofKi-67inIungcancertissues.ThecorrelationbetweenNORADandKi-67expressioninlungcancertissueswasanalyz
8、edbylinearregression.TheresultsofmiRNAsequencingwerecombinedwithbiologicalonlinesoftware,andthepossibilityofNORADbindingtomiR-26b-5pandmiR-654-5pwasanalyzedbyIucifasedetection.A549cellsweredividedintoblankControlgroup(Control),si-NORADgroup,miR-26b-5pmimics,miR-654-5pmimics,si-NORADandmiR-26b-5pmimi
9、cscombinedgroup,si-NORADandmiR-654-5pinthecombinedmimicsgroup,thesi-NORADgroup,miR-26b-5pmimicsandmiR-654-5pmimicswererespectivelyorjointlytransfectedintoA549cellsbyliposomemethod.24hlater,CellproliferationwasdetectedbyEdU,apoptosiswasdetectedbyAnnexinV-FITC/PIdoublestaining,andapoptosisrelatedprote
10、ins(Bad,Bcl-2,Cleavedcaspase-3)expressionwasdetectedbyWesternblot.ResultsTheexpressionofNORADinlungcancertissuesandlungcancercellswassignificantlyincreased(allPVo.01),andtheexpressionlevelofNORADwaspositivelycorrelatedwiththeexpressionofKi-67(r=0.646,PVO.01).TheexpressionsofmiR-26b-5pandmiR-654-5pin
11、Iungcancertissuesandcellsweresignificantlydecreased(allP0.01).BiologicalonlinesoftwareandIuciferasedetectionverifiedthatNORADhadbindingsiteswithmiR-26b-5pandmiR-654-5p.Inlungcancertissues,theexpressionofmiR-26b-5p(r=-0.403,P0.01)andmiR-654-5pQ=-0.423,P0,01)wasnegativelycorrelatedwiththeexpressionofK
12、i-67.TheexpressionsofmiR-26b-5p(r=-0.435,PVo.05)andmiR-654-5p(r=-0.395,PVO.05)werenegativelycorrelatedwithNORAD.ComparedwiththeControlgroup,si-NORADsignificantlyinhibitedtheproliferationofA549cells(P0.01)andpromotedapoptosis(PVo.01),andsignificantlyincreasedtheexpressionofBadandCleavedcaspase-3(allP
13、0,01),andsignificantlydecreasedtheexpressionofBcl-2(P0.05).Comparedwithsi-NORAD,si-NORADcombinedwithmiR-26b-5pmimicsgroupandsi-NORADcombinedwithmi-654-5pmimicsgroupcouldfurtherinhibitcellproliferation(P0.01)andpromotecellapoptosis(P0.01).TheexpressionofBadandCleavedcaspase-3wassignificantlyincreased
14、(allPNCl-HI299、NCl-HI395、NCI-HI650)购自于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，HFLl(人胚肺成纤维细胞)购自于武汉灵思生物技术有限公司，由本实验室保存。AnnexinVFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司，免疫荧光检测试剂盒购自于武汉灵思生物有限公司，RT-qPCR检测试剂盒购自于美国Bio-Rad公司，LiPofeCtamine3000转染试剂盒购自于美国InVitrogen公司，Anti-Badantibody、Anti-Bcl-2antibodyAnti-CleavedCaspase-3antibodyAnti
15、-ki-67antibody购自于英国abeam公司；Anti-GAPDHantibody购自于武汉三鹰生物技术有限公司。hsa-miR-26b-5pmimicshsa-miR-654-5pmimics及NC(NegativeContrOl)购自于广州锐博生物，si-NORAD(5,-AAGCCACCUUUGTGAACAGUA-3。购自上海吉玛制药技术有限公司。RT-qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1所示。表1RT-qPCR引物序列Table1PrimersofRT-qPCR基因名称上游序列(5,-3,)下游序列(5*-3)NORADCctggaaggtgagc
16、gaagtAgagggtggtgggcattthsa-miR-26b-5pTatctagacatctgctacctcAtgcggccgcgattcaacaagCTCCCGACAACtctacagctatattgccagcchsa-miR-654-5pTggtgggccgcagaacatgtACGAPDHAACGGATTTGGTCGTATTGGGAAGATGGTGATGGGATTU6CtcgcttcggcagcacaAacgcttcacgaatttgcgt10对肺癌患者肿瘤及配对的癌旁组织均为2019年1月-2021年12月在我院心胸外科住院，行肺手术后经病理检查明确诊断为肺癌患者。患者年龄44
17、76岁，平均年龄559.38l岁，其中男性4例、女性6例。肿瘤及其配对的癌旁样本置于液氮中保存。每位患者均己签署知情同意书，由我院伦理委员会审查和批准。HERAcell150il型CO2培养箱购自于美国Thermo公司；Lightcycler480型RT-qPCR仪购自于美国ROChe公司；NIKoNDS-U3正置荧光显微镜购自于日本尼康；MUltiSkanSky全波长酶标仪购自于美国Thermo公司；FACSCalibUr流式细胞仪购自于美国BD公司；PowerPaceBasic型电泳仪购自美国Bio-RAD公司。1.3 实验方法1.3.1 肺癌组织样本RNAseq分析取6个肺癌组织及配对的
18、癌旁组织样本经过RNA抽提、纯化、建库之后，基于InUminaHiSeq2500测序平台，对这些文库进行双末端（Paired-end,PE）测序，筛选差异表达基因（筛选标准：log2Fo!dChange1,P-valuehsa-miR-26b-5p表达TRlZol裂解法，提取肺癌组织及细胞总RNA,逆转录试剂盒逆转录成cDNA,RT-qPCR检测NORAD、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-26b-5p的表达。数据以2.仃表示，（：=目的基因Ct值-内参基因Ct值，aac=实验组（Ct（目的基因）-（内参基因）-对照组（Ct（目的基因）-Ct（内参基因）。1.3.5 免疫荧光检测肺
19、癌组织中Ki-67表达肺癌及配对的癌旁组织样本经冰冻切片，室温晾干水分，4%多聚甲醛固定10min,待4%多聚甲醛完全干后置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。抗原修复后，5%BSA抗原阻断，滴加ki-67抗体（1:300）,4C孵育过夜；PBS清洗3次，每次5min,滴加Cy3标记的二抗，37C孵育60min,PBS清洗3次，每次3min,滴加抗荧光淬灭封片剂。利用日本尼康正置荧光显微镜（NlKoNDS-U3）采集照片。利用Image-ProPIUS6.0分析软件计算每个样本中Ki-67的平均荧光值。1.3.6 细胞分组及转染取对数生长期的A549细胞，IX104
20、CelISmL的细胞量传于细胞培养6孔板，将A549细胞随机分成：空白对照组(COntro1)、si-NORAD组、miR-654-5pmimics组、miR-26b-5pmimics组、si-NORAD与miR-654-5pmimics联合组、si-NORAD与miR-26b-5pmimics联合组。si-NORADmiR-654-5pmimics、miR-26b-5pmimics按照Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒说明书转染入A549细胞，24h后，收集细胞对应检测。1.3.7 EdU检测细胞增殖将37C预热的EdU工作液(20M)加入6孔板，37、5%Co2继续培养2h
21、后，去除培养基，PBS清洗细胞3次，加入4%多聚甲醛，室温固定15min,每孔用ImL细胞通透液(含0.3%TritonX-Ioo的PBS),室温孵育10-15min,PBS清洗细胞3次后，每孔加)入5LPK碘化丙咤)染色，荧光显微镜拍照。1.3.8 细胞凋亡检测收集细胞，按照试剂盒操作说明，预冷乙醇固定后，加入10LAnnexinV-FITC及碘化丙咤(Pl)染色液，轻轻混匀，室温避光孵育15min,随后置于冰浴中，上机检测，FlowJoDongIe分析软件进行分析。1.3.9 荧光素酶检测将包含NORAD与miR-26b-5pmiR-654-5p结合位点的野生型(Wt)及突变型(MUt)序
22、列的pmiGLO载体分别与miR-654-5pmimicsmiR-26b-5pmimics或NC片段传染A549细胞，24h后，收集细胞，利用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素的表达。1.3.10 Westernblot检测A549细胞利用RIPA裂解，冰上孵育20mim后，4,14000g离心3-5min,取上清，BCA定量,每孔按照20g蛋白量上样,SDS-PAGE电泳后，转膜,分别以兔抗Ki-67(1:800)、Bad(1:800)、Bcl-2(1:500)、CleaVedCaSPaSe-3(1:800)及GAPDH(1:10000),4、孵育过夜后，TBST漂洗3次，加入HRP酶标抗兔二抗。
23、加入ECL发光液膜置于全自动化学发光分析仪中扫描，通过TANONGIS软件读取相关条带灰度值。1.4 统计分析所有实验均重复三次，数据以灭S表示。实验数据采用GraPhPadPriSm6.0分析及绘图。多组间数据的比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，组织标本中NORAD与miR-26b-5pmiR-654-5p表达采用配对f检验，利用直线回归分析肺癌组织中NORAD与Ki-67、miR-26b-5p及miR-654-5p与Ki-67及NORAD与miR-26b-5p.miR-654-5p的表达相关性，PV005为差异有统计学意义。2.1 2结果2.2 1.ncRNANORA
24、D在肺癌中的表达及其与Ki-67表达相关性分析RNA-seq分析发现，与癌旁组织比较，NORAD在肺癌组织中的表达显著升高(咋2尸NdChange=6.455,P=O.000)。RT-qPCR检测发现，与癌旁组织相比，肺癌组织中NORAD的表达显著上调0=6.430,P=0.000);RT-qPCR检测发现，与HFLl细胞比较，肺癌细胞中NORAD的表达显著上调(F=46.910,P=0.000)o免疫荧光检测发现，与癌旁组织相比，肺癌组织中Ki-67的表达显著升高(/=9.100,P=0.000):直线回归分析，肺癌组织中NoRAD的表达与Ki-67的表达呈现正相关(r=0.646,P=0.
25、000)o如图1所示。oC5ase-?(E)刈(D)Para-carcinomatissue 1#DAPIMergeTumor tissucl#Ki-67Tumor tissue!#Para-carcinoma tissue!#200150100ar=0.646,0.(M)0图1NORAD在肺癌中的表达及其与Ki-67表达相关性分析Figure.lNORADexpressioninlungcancerandcorrelationanalysisofKi-67expression注：（八）,RNA-Seq分析LnCRNA表达VOlCano图；(B),RT-qPCR检测NoRAD在肺癌组织及配对的
26、癌旁组织中的表达；(C),RT-qPCR检测NORAD在人肺癌细胞及胚肺成纤维细胞中的表达；(D)-(E),免疫荧光检测分析Ki-67在肺癌及配对的癌旁组织中的表达；(F),直线回归分析肺癌组织中NORAD与Ki-67的表达呈现正相关。*表示比较具有统计学意义(PV0.01)oNote:（八）:LncRNAexpressionVolcanofigurewasanalyzedbyRNA-seq;(B):TheexpressionofNORADinlungcancertissuesandpairedparacancertissuesbyRT-qPCR;(C):TheexpressionofNORA
27、DinIungcancercellsandhumanembryoniclungfibroblastsbyRT-qPCR;(D)-(E):ImmunofluorescenceassaywasusedtoanalyzetheexpressionofKi-67inlungcancerandpairedadjacenttissues(200X);(F):LinearregressionanalysisshowedapositivecorrelationbetweenNORADandKi-67expressioninlungcancertissues.*indicatesthatthecompariso
28、nisstatisticallysignificant(P0.01).2.3 肺癌中NORAD互做miRN筛选及其在肺癌中的表达分析利用在线分析软件starbase%jefferson、miRDB及miRNA测序数据联合分析NORAD可能互做miRNA,结果发现，miR-26b-5p、miR-654-5p为NoRAD候选互做miRNA。RNA-seq分析发现，miR-26b-5p、miR-654-5p在肺癌组织中的表达显著降低(l0g2Rdchimge分别为_3.654、2165,均P=O.000),RT-qPCR检测发现，与癌旁组织相比，肺癌组织中miR-26b-5p(r=6.821,P=0
29、.000)与miR-654-5p(=4.075,M).000)的表达显著下调；与HFLl细胞比较，肺癌细胞中miR-26b-5p(F=41.890,P=OOOO)与miR-654-5p(F=39.260,P=0.000)的表达显著下调/=32.010,P=0.000)o直线回归分析，肺癌组织中miR-26b-5pg-0.403,P=0.000)miR-654-5pQ=-0.423,P=0.000)的表达与Ki-67的表达呈现负相关。如图2所示。图2肺癌中NORAD互做miRN筛选及其在肺癌中的表达分析Figure.2ScreeningandexpressionanalysisofNORADbo
30、undmiRNAinlungcancer注：（八）,RNA-seq分析肺癌中miRNA表达Volcano图;(B),NORAD互做miRNA分析;(C),RT-qPCR检测miR-654-5p在肺癌组织及配对的癌旁组织中的表达;(D),RT-qPCR检测miR-654-5p在人肺癌细胞及胚肺成纤维细胞中的表达；(E),RT-qPCR检测miR-26b-5p在肺癌组织及配对的癌旁组织中的表达；(F),RT-qPCR检测miR-26b-5p在人肺癌细胞及胚肺成纤维细胞中的表达;(G),直线回归分析肺癌组织中miR-654-5p与Ki-67的表达相关性；（三）,直线回归分析肺癌组织中miR-626b
31、-5p与Ki-67的表达相关性。*表示比较具有统计学意义(P0.01)oNote:（八）:RNA-seqanalysisofmiRNAexpressionVolcanoinlungcancer;(B):NORADmutualmiRNAanalysis;(C):RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofmiR-654-5pinlungcancertissuesandpairedparacancertissues;(D):RTqPCRwasusedtodetecttheexpressionofmiR-654-5pinhumanlungcancercellsandem
32、bryoniclungfibroblasts;(E):RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofMir-26b-5pinlungcancertissuesandpairedparacancertissues;(F):ExpressionofmiR-26b-5pinhumanlungcancercellsandembryoniclungfibroblastswasdetectedbyRT-qPCR;(G):LinearregressionanalysisofthecorrelationbetweenmiR-654-5pandKi-67expressioninlun
33、gcancertissues;（三）:LinearregressionanalysisofthecorrelationbetweenmiR-26b-5pandKi-67expressioninlungcancertissues.*indicatesthatthecomparisonisstatisticallysignificant(PmiR-654-5p的表达相关性分析直线回归分析，肺癌组织中，NoRAD与miR-26b-5p(-0.435,P=0.023)miR-654-5p(r=-0.395,P=0.041)的表达呈负相关。荧光素酶检测分析发现,miR-26b-5pmimics(/=14
34、.270,P=0.000)miR-654-5pmimics(r=13.31O,P=O.OOO)与野生型NoRAD载体(Wt)共转染后，荧光素酶的表达显著降低；而miR-26b-5pmimics(/=1.670,P=O.170)miR-654-5pmimics(r=13.310,M).000)与突变型NoRAD载体(MUt)共转染后，荧光素酶的表达无显著变化。如图3所示。r=-0,395,P=0.041y9B 一 Er=-0.435,P=0.023,q9z,HENORAD-WT 5, cuggucGUGGUGGUGCCCACCu 3 I I I I IIIIIII has-miR-654-5p
35、3, CguguaCAAGACGCCGGGUGGu 5 XX H XXXXXXXNORAD-Mut 5 CUggUCCCGGCCGUCUUUGUUU 34NORADNC)RAD-WT5,CaaauuaacuccUUACUUGAa3Iiiiiiiihas-miR-26b-5p3,UggauaggacuuAAUGAACUu5XXXXXXXXNORAD-Mut5,CaaauuaacuccCCUAGGACa3图3肺癌中NORAD与miR-26b-5pmiR-654-5p的表达相关性分析Figure.3CorrelationanalysisofNORADexpressionwithmiR-26b-5pa
36、ndniR-654-5pinlungcancer注：（八）,直线回归分析NORAD与miR-654-5p的表达相关性；(B),直线回归分析NoRAD与miR-26B-5p的表达相关性；(C),NORAD与miR-654-5p结合位点；(D),荧光素酶检测NORAD与miR-654-5p结合；(E),NORAD与miR-26b-5p结合位点；(F),荧光素酶检测NoRAD与miR-26b-5p结合。*表示比较具有统计学意义(PVo.01)。Note:（八）:ThecorrelationbetweentheexpressionofNORADandmiR-654-5pwasanalyzedbylin
37、earregressionanalysis;(B):LinearregressionanalysiswasperformedtoanalyzethecorrelationbetweentheexpressionofNORADandmiR-26b-5p;(C):NORADbindingsitewithmiR-654-5p;(D):LuciferasedetectionofNORADbindingtomiR-654-5p;(E):NORADbindingsitewithmiR-26b-5p;(F):LuciferasedetectionofNORADbindingtomiR-26b-5p.*ind
38、icatesthatthecomparisonisstatisticallysignificant(P0.01).2.5 NORAD对肺癌细胞增殖及凋亡的影响与Congl组比较，抑制NORAD(Si-NoRAD)后，A549细胞的增殖能力显著降低；过表达miR-26b-5p、miR-654-5p后，A549细胞的增殖能力显著降低；与Si-NoRAD组比较,同时抑制NORAD及过表达过表达miR-26b-5p、miR-654-5p后，A549细胞的增殖能力进一步降低。与Control组比较,抑制NORAD后,A549细胞的凋亡比例显著增加(UIo.250,P=0.000);过表达miR-26b-
39、5p(U18.56,P=0.000)miR-654-5p(r=10.030,P=0.000)后，细胞凋亡显著升高；与Si-NORAD组比较，同时抑制NORAD及过表达miR-26b-5p(/=7.960,P=O.001)、miR-654-5p(/=3.704,P=0.020)后，A549细胞的凋亡进一步升高。如图4所示。(B)Controlsi-NOfbDmiR-654-5pmiR-26b-5pmimieimimicsM-NORAD-miR-26b-5p-_+mimicsmiR-654-5p_+.mimics图4NoRAD抑制后，肺癌细胞增殖及凋亡的影响Figure.4Cellprolifer
40、ationandapoptosisoflungcancercellsafterNORADinhibition注：（八）,EdU检测细胞增殖；(B)-(C),流式细胞术检测细胞凋亡。*表示比较，具有差异具有统计学意义VVO.05);*表示比较具有差异具有统计学意义(P0.01).Note:（八）:EdLJdetectedcellproliferation;(B)-(C):Cellapoptosiswasdetectedbyflowcytometry.*indicatesstatisticallysignificantdifferences(P0.05);*indicatesstatistical
41、lysignificantdifferences(Psi-NORAD组、si-NORAD与miR-654-5pmimics联合组、si-NORAD与miR-26b-5pmimics联合组中Bad相对表达量分别为0.3390.018、0.4350.023、0.5210.02k0.6060.024、0.7110.027.0.7960.019；BCI-2相对表达量分别为0.54560.0270.4670.015、0.4290.0190.3720.015、0.3110.013、0.2470.004；CleaVedCaSPaSe-3相对表达量分别为0.3440.030、0.4420.013、0.5160
42、.017、0.5770.017、0.6490.019.0.7100.038。与ContrOl组比较,si-NORAD后，A549细胞中Bad(r=9.498,P=0.000).Cleavedcaspase-3(r=6.715P=0.000)相对表达量均显著升高，而Bcl-2的相对表达量显著降低(/=6.102,P=0.003);miR-654-5pmimicsmiR-26b-5pmimics得到类似的结果。si-NORAD与miR-654-5pmimicsmiR-26b-5pmimics联合后，与Si-Ne)RAD组比较，A549细胞中Bad(/=3.374、5.715,P=O.025、0.005)、Cleavedcaspase-3(r=4.6806,425,P=O.033、0.000)相对表达量进一步升高，而Bcl-2的相对表达量显著降低(/=2.946、6.153,尸二0.042、0.00)。结果如图5所示。(A)si-NORADmiR-26b-5pmimic
