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1、实验 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定,目的要求：1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法,1.原理,碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。,在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中特别注意以下几点：取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低
2、温下保存。选择来源丰富，酶含量高的材料。用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。,酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2 mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 nm 值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为：在37下，以2 mmol/
3、L pNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin-Phenol reagent）显色法,操作方法3.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取每组称取20 g牡蛎（蒸馏水洗净），加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5，含0.1 mol/L NaCl），（两组一起）于高速组织捣粹机匀浆1 min，于冰箱4放置1 h进行抽提。室温离心，3000 r/m 20 min，收集离
4、心上清液，（两组分开）并量体积。（留2 mL上清液，待测酶的比活力。）在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。室温离心，3000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。（留2 mL上清液，对0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl 透析平衡，待测酶的比活力。）,(5)0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。(6)室温离心，4000 r/m 20 min
5、，收集沉淀物。(7)得到沉淀物，溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透析袋，对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。(8)取出酶溶液，冷冻高速离心（0 25000 r/m 30 min）。(9)离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于4冰箱保存。,20 g牡蛎,加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5，含0.1 mol/L NaCl），于高速组织捣粹机匀浆1 min，于冰箱4放置1
6、 h进行抽提。,室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。,匀浆液,上清液,缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。,加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。,0.35饱和硫酸铵上清液,沉淀,溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透析袋，对
7、0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止,粗酶液,3.2 比活力测定 对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）：取15支试管编号，0号一支，17号各二支，按下列表格操作。,以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。8.80103(mol/L)-1cm-1,3.2.2 酶活力的测定,以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产物的mol数，算出酶活力。,蛋白浓度的测定本实验采用紫外吸收法（OD280）测定蛋白浓度。上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用Tris
8、-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。,3.3 结果处理,计算：式中：A为稀释倍数，B为由标准曲线查得的pNP mol数，t为反应时间，C为由标准曲线查得的蛋白mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数)V2为测定酶活力所用的酶量(mL数)酶的比活力（U/mg）酶活力（U/mL）蛋白浓度（mg/mL）纯化倍数=各步比活力/第一步比活力得率%=各步总活力*100/第一步总活力,将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做）,4.注意事项（1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。（2）测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水浴锅中预热及反应。（3）紫外分光光度测定需用石英杯。（4）稀释倍数（5）移液器的使用,返回,
