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1、生物化学实验方法 及常用仪器介绍,授课：王琼联系方式：2186772（O）；E-mail：,碎片分离,精制（结晶、干燥）,分离纯化一般过程,一、离心技术,离心（centrifuge）离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。离心技术是利用离心力对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种技术。,离心技术简介,离心分离是制备生物样品广泛应用的重要手段，可以分离：活体生物（细胞、微生物、病毒）细胞器（细胞核、细胞膜、线粒体）生物大分子（核酸、蛋白质、酶、多聚物）小分子聚合物,离心技术简介,离心技术的发展,1911-1912年，开始生产和使用低速（3,
2、000 rpm以下）的商品化台式离心机,1923-1926年，瑞典UPPSALA大学Svedberg等科学家试制了世界上第一台试验型超速离心机（45,000 rpm）。1926年测定了马血红蛋白的分子量，获得诺贝尔化学奖。,1929年，Lamm完成了沉降方程。计算了沉降速度。定义了沉降系数 1940 年，Svedberg与Pederson出版了世界上第一本有关离心技术的专著 1943年，Pickels研制成现代固定角式离心转子,离心技术的发展,离心技术的发展,1951年，Brakke在差速离心的基础上发展了速率区带离心法。Kahler研制成功甩平转子；1955年，Anderson发明了区带转头
3、，并用区带离心法首次证明了DNA双螺旋结构半保留复制的假说；1955年以后，开始了超速、高速、低速大容量离心机以及分析用超速离心机的商品化生产,1957-1959年，Meselson、Duve等开发了等密度离心法。19641966年，Anderson等开始建立转子区带离心技术并开发了低、高、超速区带转头。1975年，垂直管转子被开发并用于Dupont-Sorvall油透平驱动的超速离心机。1981年，美国Beckman公司开发的用于细胞离心纯化的“淘洗”转头供应市场。,离心技术的发展,1.离心力 Centrifugal force(F)F=m2r 其中：m沉降粒子的有效质量；粒子旋转的角速度；
4、r粒子的旋转半径(cm)=(rad/sec),离心技术原理,2N,60,2.相对离心力 Relative centrifugal force(RCF)RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=F离心力/F重=m2r/mg=2r/g=(rad/sec)RCF=42 n2r/3600g=1.1210-5 n2r 其中：n每分钟的转数(rpm),离心技术原理,从外界因素看，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。,2n,60,只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样
5、的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半径“rav”代替：rav=(rmin+rmax)/2,离心技术原理,3.沉降速度（Sedimentation velocity）指在强大离心作用下，单位时间内物质运动的距离。=d2(-)g/18 Stokes方程 其中：颗粒的沉降速度 d颗粒直径 颗粒密度 介质密度 介质的粘度,离心技术原理,1、颗粒沉降速度与颗粒直径平方成正比，颗粒大沉降快2、颗粒沉降速度与颗粒和介质密度差成正比，密度之差越大沉降越快,4.沉降系数（sedimentation coefficient，S）颗粒在单位离心力作用下的沉降速度称为该颗粒的沉降系数，把10-13秒作为一个单位，称
6、为斯维得贝格单位，或称沉降系数单位，用S表示。,离心技术原理,S,式中：S沉降系数 沉降速度 r旋转半径 介质粘度,d颗粒直径样品中颗粒的密度溶剂的密度,例如：溶菌酶的沉降系数为2.1510-13 s，通常叫做2.15 S；过氧化氢酶的沉降系数为11.3510-13 s，就称11.35 S；大肠杆菌核蛋白体是70 S，由两个亚基组成，用超离心方法测其沉降系数分别为30 S和50 S。,离心技术原理,蛋白质的沉降系数一般在1-200 S之间。,离心技术原理,某些生物样品的沉降系数、相对离心力和转速的范围,离心机结构,离心机分类,分离物大小：150 mMicrobial cell，hemocyte
7、，cell,分离物大小：0.11 mMitochondria，Lysosome，cell Well,分离物大小：0.0020.1 mDNA，RNA，Virus，Protein，Enzyme,根据转速,根据用途,离心机分类,离心机分类,1、低速离心机最大转速40007000rpm左右，最大相对离心力近22209420g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作。用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。,2、高速冷冻离心机最大转速为1500026000rpm左右，最大相对离心力为16100801100g，最大容量
8、可达3升，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、水平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示。通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。,离心机分类,3、超速离心机转速可达55000150000rpm，相对离心力最大可达3636009011000g，离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速离心机能使过去仅仅在电子显微镜下观察到的亚细胞器得到
9、分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。,离心机分类,依材质分类：铝合金：较轻,耐受强度较弱,适合在较低的转速下使用钛合金：耐受强度不错,重量也比不锈钢轻不锈钢：耐受强度最好,但材质本身太重碳纤维：具有抗各种腐蚀的能力，重量只有铝合金转子的二分之一,钛合金转子的五分之一，使用寿命更长。,离心机转子种类,角转子（angle rotor）甩平转子（swinging bucket rotor）垂直转子（vertical tube rotor）区带转子（zonal rotor）连续流动转子（continuous flow rotor）,离心机转子种类,依外形分类：,角转子：离心管放置的位置与转
10、头的旋转轴之间成一个固定角度，通常在14-40之间。适用于差速离心，也可用于等密度离心。特点：容量大，转头内容纳的离心管多。,角转子（angle rotor）,离心机转子种类,Drive shaft hole,离心机转子种类,角转子的特点：重心低,转速可较高样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径“管壁效应”：有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。,离心机转子种类,甩平转子：离心管组装在转子的吊桶里，离心机处于静止状态时离心管为垂直方向，即离心管与离心轴承平行方向。离心时离心管与旋转轴垂直。承受的最大离心速度在65,000
11、 r/min左右，最大离心力在400,000 g。适合于密度梯度离心，进行差速离心效果不理想。,甩平转子（swinging bucket rotor）,离心机转子种类,甩平转子运行状态,600 rpm/min,离心机转子种类,甩平转子的特点：转子的重心位置较高，转速较低 样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径对于多种成分样品分离特别有效 常用于速率区带离心和等密度离心,离心机转子种类,垂直转子（vertical tube rotor）,离心机转头种类,垂直转子：是指离心管与旋转轴成平行方向，离心管垂直插入转子孔内，在离心过程中始终与旋转轴平行。承受的最大离心速度在100,000 r/min左右，
12、最大离心力在700,000g。比较适合速率区带离心和等密度离心，尤其适合于质粒DNA 的分离纯化，但不适合于差速离心。,转头停止状态,垂直转头的运行状态,离心机转头种类,当转子旋转时，离心管中的液体层改变方向，从开始的水平方向改成垂直方向，当转子降速时，垂直分布的液层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成水平方向。,为一空腔，没有离心管，样品液直接放在腔内。适用于大量样品的分离。最大离心速度：60,000 rpm左右最大离心力：250,000g,区带转头（zonal rotor）,离心机转头种类,由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用
13、下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。,连续流动转头（continuous flow rotor）,离心机转头种类,最大离心速度：32,000 rpm左右最大离心力：100,000g可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离,塑料离心管：聚乙烯（PE）管、纤维素（CAB）管、聚碳酸酯（PC）管、聚丙烯（PP）管、异质同晶聚合物（PA）、聚氧化乙烯對苯二酸（PET），其中PP管性能较好。优点：透明（或半透明），易于观察；硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点：易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢离心管：强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。,离心管,沉淀离心差速分级离心密度梯度离心,离
14、心分离方法,沉淀离心是应用最广的一种离心方法，一般是指介质密度约1g/ml，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心的作用下完全沉淀下来。主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料（密度在1.08-1.12 g/ml左右）；病毒和染色体DNA等（密度在1.18-1.31 g/ml左右）。沉降速度与离心力和颗粒大小有关。,离心分离方法,沉淀离心（pelleting）,沉淀离心示意图,离心分离方法,建立在颗粒的大小、密度和形状有明显的不同，沉降系数存在较大差异的基础上进行分离的方法。差速离心比较适用于大小相差明显的细胞或细胞器的分级分离，经过多次离心可以得到满意结果。沉降顺序：整个细胞或
15、细胞碎片核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。差速离心每次得到的沉淀物都含有极少量的小于该s值的沉淀物质。,差速离心（differential velocity centrifugation）,离心分离方法,差速离心示意图,离心分离方法,Low speed,High speed,例：一个体积为100 mL悬浮液中有三种物质A、B、C，沉降系数分别为100S、10S、1S。采用差速离心的方法分离。,第一步：物质A的沉降。A100沉淀时，沉淀物中有10的B和1的C。多次沉淀纯化物质A。,第二步：物质B的沉降第三步：物质C的沉降,离心分离方法,差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。优点是
16、：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。,离心分离方法,密度梯度离心（density gradient centrifugation）,速率区带离心（rate zonal centrifugation）分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器,等密度区带离心（isopycnic centrifugation）分离密度不等的颗粒,（区带离心）密度梯度离心,离心分离方法,分离密度相近而大小不等的细胞
17、或细胞器。梯度液设计的最大密度小于样品颗粒（各种组分）的密度。离心前预先在离心管内装入密度梯度介质，被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面。离心时样品中的组分以不同的沉降速度沉降，离心时间应该控制在最重的样品沉淀之前，结束时不同的组分以纯样品带方式存在于梯度液之中。,速率区带离心,离心分离方法,分离密度不等的颗粒。梯度液设计的密度范围正好包括所有待分离颗粒的密度。样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,等密度区带离心,离心分离方法,速率区带离心和等密度区带离心比较,离心分离方法,该法的优点是：分离效果好，可一
18、次获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点：离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。,离心分离方法,密度梯度溶液,目前使用的密度梯度材料主要有：CsCl2,LiCl,RbCl，酒石酸钾钠，甘油，蔗糖，聚蔗糖等。,常使用的梯度液为4%-20%（W/V）蔗糖离心管顶部为4%的蔗糖，密度1.018 g/mL离心管底部为20%的蔗糖，密度为1.077 g/mL,离心分离方法,正确选择密度梯度的范围。对样品的生物活性不能有影响。不能影响所使用的测量技术。注意能否进行高温消毒，
19、对转头是否有影响。,梯度材料的选择,离心分离方法,1、虹吸法：用一根细管插到离心管的底部，将溶液吸出，用试管分部接收，然后进行分析。,梯度的取出,离心分离方法,1、顶替法：把一种很稠的介质，如60-70的蔗糖溶液慢慢注入离心管底部，将离心管中的溶液顶替出来。,离心分离方法,2、穿刺法：将离心管固定在支架上，在离心管底部贴一块胶布，防止穿刺后液体泄漏。用针头仔细穿过塑料离心管的底部，此时液体顺针头缓缓地逐滴流出，可用试管按体积分部接收，然后进行分析。,离心分离方法,4、冷冻切段法：将离心好地试管进行冷冻，再切成段，将不同的区带分开。,离心分离方法,3、虹吸法：用蠕动泵或吸管将样品从上至下逐层按区
20、带吸出并分管收集。泵管或吸管注意每区带一管，不能混用。,离心机使用注意事项,一、不可使用有机溶剂,二、转子速度的设定,离心机转子标出的最高转速一般是在使用塑料离心管、样品的平均密度低于1.2g/cm3或者按照说明书的要求低于某一装载量时，才能达到的最高安全使用转速。当离心管、管帽或套管材质更换成大密度材质时，应降低运转速度（低于最大速度）。转头都有一定的使用极限，到一定时限后，最高使用转速必须降低10-20%。,离心机使用注意事项,当离心样品平均密度大于1.2克/立方厘米，按下式计算实际最高转速：,有些转子说明书中给出的是转子的最大装样量，按下式计算实际最高转速：,离心机使用注意事项,三、样品
21、的装载和平衡,由于离心时产生很大的离心力，当转头所带的样品处于不平衡状态时，会产生很大的力矩。轻者引起机器发抖和震动，重者会扭断转轴造成事故。,离心机使用注意事项,静平衡：对称的两管样品等重。动平衡：离心时产生的力矩不仅与样品的重量有关，还和样品的旋转半径有关。处于对称位置的两个离心管必须装载密度相近的样品。,离心机使用注意事项,放置已平衡好的Tube和Bottls,其放置的位置必須为对称,两个对称的Tube和Bottls,如右图情形是不允许的,离心机使用注意事项,四、tube/bottles的放置,在Rotor body上的bucket的孔洞必須全部裝滿,不论是否有包含样品*运转时必須將所有
22、的Buckets都放入到Rotor body內,其主要預防在启动运转时造成Buckets变形,（illustration of correct set）,（illustration of incorrect setting）,离心机使用注意事项,五、清洗及消毒Rotor1.清洗,清洗,涂抹,使用水或中性清洁剂清洗，并且需使用去离子水冲洗(清洁剂:pH 59),铝合金/钛合金:低于100C碳纤维:低于80C,干燥,表面:Silicone grease 螺纹部分:Aluminum LubricantPacking/O-ring:Vacuum grease,离心机使用注意事项,2.消毒,消毒的方式,
23、铝合金/钛合金 Rotor,碳纤维 Rotor,高压蒸汽 煮沸消毒,紫外线消毒200300nm,Ethylene oxide环氧乙烷 气体消毒 Formaldehyde甲醛,70%Ethanol乙醇 化学药剂 3%Hydrogen peroxede 3%Formalin福尔马林,Rotor耐热温度 100C 80C,离心机使用注意事项,Tube/Bottles1.清洗,清洗的方式,Tube/Bottles,附件,PA,PEPET,PC,Cap,adapter ect.,水性洗涤剂(pH9)温水(50C)超声波清洁(清洗剂pH7),干燥的方式,放在空气中自然干燥,离心机使用注意事项,2.消毒,消
24、毒的方式,Tube/Bottle,PA PC PET PE,115C 30分钟 高压蒸汽 121C 20分钟 126C 15分钟 煮沸消毒 1530分钟,紫外线消毒200300nm,Ethylene oxide环氧乙烷 气体消毒 Formaldehyde甲醛,70%Ethanol乙醇 化学药剂 3%Hydrogen peroxede 3%Formalin福尔马林,离心机使用注意事项,二、细胞破碎技术,细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。有效的细胞破碎对分离和纯化任何细胞内物质都
25、是必要的。,概述,细胞破碎技术,细胞破碎技术,细胞破碎技术,机械法,1.珠磨法（Bead mill）,细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。,高速珠磨机工作原理,细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞壁破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。,细胞破碎技术,2.高压匀浆法（High-pres
26、sure homogenization）,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列过程中经历了高速造成的剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,细胞破碎技术,不宜采用高压匀浆法的细胞类型易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,细胞破碎技术,大、中、小型高压匀浆器,3.超声破碎法（Ultrasonication）,利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大
27、和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。,细胞破碎技术,细胞破碎技术,影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。,细胞破碎技术,物理法,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。此法是利用细胞含有大量水份，在快速冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破，达到破碎细胞的目的。主要适
28、用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细菌。冻融法十分简单，不需特殊设备，在实验室使用很方便，但破碎率低，需反复多次。,细胞破碎技术,1.反复冻融法,细胞破碎技术,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,2.渗透压法（Osmotic pressure）,化学渗透法（Chemical permeation）,某些化学试剂，如有机溶剂、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂、抗生
29、素等，可以改变细胞壁或膜结构的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择性的渗透出来。,细胞破碎技术,1.表面活性剂,表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)牛黄胆酸钠十二烷基磺酸钠,细胞破碎技术,2.EDTA螯合剂,主要是处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,细胞破碎技术,3.有机溶剂,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯
30、及高级醇等。与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。盐酸胍和脲是常用的变性剂。,细胞破碎技术,化学渗透法的缺点通用性差 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%有些化学试剂有毒，引起新的污染化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度,细胞破碎技术,化学渗透法的优点对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,酶溶法（Enzymatic Lysis）,1.外加酶法,利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到
31、部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,细胞破碎技术,常用的溶酶,溶菌酶-1，3-葡聚糖酶-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶等,细胞破碎技术,酶溶法的优点：发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整酶溶法的缺点：溶酶价格高溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在。,细胞破碎技术,1.自溶法,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激
32、活剂和细胞代谢途径等。缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性；自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,细胞破碎技术,机械法和非机械法破碎的比较,细胞破碎技术,细胞破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合与上游过程相结合与下游工程相结合,细胞破碎技术,多种破碎方法相结合,化学法、酶法、机械法相结合。如：酶法与高压匀浆法相结合。溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。,细胞破碎技术,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成
33、有一定的影响。在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂(如青霉素)，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,与上游过程相结合,细胞破碎技术,细胞破碎技术,与下游过程相结合,三、层析技术,层析技术，又名色谱技术。是一种利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中以不同程度分配，借此将各组分分离的技术。
34、,层析技术简介,无机化合物：无机盐类、无机酸类、络合物类等有机化合物：烷烃类、有机酸和有机胺类、杂环类等生物大分子：核酸和核苷酸类、蛋白质、酶及肽类、多糖及寡糖类、激素类等活体生物：病毒、细菌、细胞器等,层析技术简介,1906年，俄国植物学家茨维特分离植物色素,层析技术的发展,1931年，R.Kuhn把卵黄中的叶黄素成功地分成黄体素和玉米素两种成分，使层析法开始为人们所重视。1938年，Taylor Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941年，Martin提出色谱塔板理论；发明了液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。20世纪50年代，Cermer等发明了气相层析技
35、术。20世纪60年代后，高效液相层析技术得到发展。1975年，出现离子色谱技术。1981年，Jorgenson创立了毛细管电泳法。,层析技术的发展,固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。,层析技术基本原理,层析技术基本原理,层析技术分类,按两相所处的状态分类,根据固定相的形状分类,层析技术分类,按层析原理分
36、类,层析技术分类,滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。看看接下来会发生什么事情,纸层析法,小实验,纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。,纸层析法,薄层层析法,TLC系统组成,薄层层析的应用,薄层层析法,2002年研究人员发现“苏丹1号”色素能造成人类肝脏细胞的DNA突变，可能致癌的特性。薄层色谱可用于苏丹红（1、2、3、4号）等非食用色素的快速检测,薄层层析法,柱层析装置图,梯度制造器,缓冲液,泵,管柱,检测器,记录仪,分部收集器,胶体装填,adaptor,reservoir,圆形滤纸,长条滤纸,薄层层析(TLC),柱层析,容量变大,容量更大,
37、加展开液,凝胶层析Gel chromatography,凝胶层析法(Gel chromatography)凝胶过滤(gel filtration)分子筛层析(molecular sieve chromatography)排阻层析(exclusion chromatography),凝胶层析法,根据混合物中各种分子的大小及形状不同，其通过固定相凝胶时，分子的扩散移动速率各异，使大小不同的分子得到分离和纯化,特点：设备简单、重复性好、操作方便、回收率高。应用范围：蛋白质、酶、核酸、多糖、激素、氨基酸等；可以测定生物大分子的相对分子质量；可以脱盐、分离物质。,凝胶层析法,三维空间网状结构,凝胶层析法
38、,固定相（凝胶）,分子筛效应-分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。,凝胶层析法,凝胶层析过程示意图,凝胶层析法,凝胶层析法,凝胶层析的优点凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。操作条件较温和，不易引起生物样品的变性失活。重复性好,样品回收率高，可进行大量样品的分离纯化。,凝胶层析的缺点要求样品和洗脱液的粘度很低。凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用，例如芳香族物质及脂蛋白等。,凝胶层析法,凝胶介质,化学稳定性,无特异性吸附,较好的耐受性,足够的机械强度,1.凝胶介质需满足
39、的条件,2.凝胶的类型,葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶复合式凝胶 Superdex,凝胶层析法,葡聚糖凝胶,1959年Porath和Flodin合成葡聚糖凝胶（商品名：Sephadex）,凝胶层析法,是由多聚葡萄糖与环氧化氯丙烷通过交联反应制成的有孔颗粒状凝胶。,葡聚糖凝胶的性质,亲水性强，在水、盐、碱性、弱酸性及有机溶剂中稳定；耐高温：干态120，湿态110；在强酸性条件下糖苷键易发生水解；氧化剂作用下羟基易被氧化；碱性条件下稳定，可以用稀碱溶液处理葡聚糖凝胶介质，除去变性的杂蛋白；对碱性蛋白质有一定吸附作用。,凝胶层析法,1962年Hierten和Mosbach合成聚丙烯酰胺凝胺（商
40、品名：Biogel）,聚丙烯酰胺凝胶,单体：丙烯酰胺（Acrylamide,简写Acr）H2C=CH-CONH2交联剂：N,N-亚甲基双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylamide,简写Bis）H2N=CH-CONH-CH2-HN-COCH=CH2,凝胶层析法,聚丙烯酰胺凝胶的性质,极端pH条件下酰胺键易被水解生成羧酸，使介质带有一定的离子交换基团。具有良好的大孔性和机械强度。对偏酸或偏碱性的化合物和芳香族类化合物均有不同程度的吸附。,凝胶层析法,琼脂糖凝胶,琼脂糖凝胶（agarose gel）由琼脂中分离出来的天然凝胶。,瑞典的Sepharose系列，美国生产的Bio-G
41、el A系列，英国的Sagavac系列，丹麦的Gelarose系列，我国生产QT系列。,凝胶层析法,琼脂糖凝胶的性质,琼脂糖凝胶是一种大孔胶，主要分离分子量为40,000以上的物质。琼脂糖凝胶在湿态保存。未经特殊处理的琼脂糖凝胶在环境温度高于56度时开始融化。可用来分离核酸及病毒。,凝胶层析法,离子交换层析Ion Exchange Chromatography,离子交换层析是以离子交换剂（具有离子交换性能的物质）为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂进行可逆交换的性质进行分离纯化的层析方式。即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。,离子交换层析,基本
42、原理,离子交换层析,离子取代优先顺序,离子交换层析,130,What happens in ion exchange?,Sampleapplicationand wash,Elution,Equilibration,Regeneration,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,离子交换层析,离子交换剂种类,在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换,离子交换层析,（二）按载体种类不同1、离子交换树脂：聚苯乙烯树脂,离子交换层析,+,离子交换层析,离子交换树脂的特性
43、多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂稳定性：离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团,2、离子交换纤维素阴离子交换纤维素 如:DEAE-纤维素，pH8.6以下分离中性或酸性物质，具二乙胺乙基阳离子交换纤维素如:CM-纤维素，一般pH4条件下使用，具有羧甲基,离子交换层析,3、离子交换凝胶分离大分子物质如：葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺（PAG）琼脂糖（Sepharose）,离子交换层析,离子交换层析的应用,主要用于分离蛋白质、多肽、氨基酸，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。,离子交换层析,举例：当pIpH时，蛋白质带净正电荷。已知蛋白质
44、X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。,建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。,离子交换层析,亲和层析Affinity Chromatography,亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术。,亲和层析法,亲和层析法的四要素：固相载体亲和配体耦合反应与配体可逆结合的生物分子,亲和层析法的作用机理：,亲和层析法,混合蛋白样品,带有配体的树脂珠（或胶粒）,洗下未结合的蛋白,含配体溶液,平衡液
45、,收集目的蛋白,亲和层析法,专一性亲和力的构成因素：,I.Conformational Match:Van der waals interaction,+,两分子间因构象互补所造成的吸引力是由范德瓦尔力所贡献,II.Interaction Forces:(1)Hydrogen bond(2)Hydrophobic interaction(3)Electrostatic interaction(4)Van der waals interaction,亲和层析法,Van der Waal interactionsbetween non-polar surfaces,Conformational M
46、atch,构型互补所造成的吸引力,亲和层析法,90kcal/mole,3kcal/mole,1kcal/mole,1kcal/mole,0.1kcal/mole,一个二级键的大约键能,二级键：次于共价键的结合能力,离子键,氢 键,疏水键,范德瓦尔力,亲和层析法,各种亲和性配体及其专一性基团,亲和层析法,具有良好的物理化学稳定性,载体的选择,均匀多孔的网状结构，有良好的渗透性,具备大量能被活化的基团，能和配体稳定结合,与样品中的各组分均没有明显的非特异性吸附,抗微生物和酶的侵蚀,亲和层析法,各类载体的优缺点,亲和层析法,配体的选择,亲和层析法,配体的分类,特异性配体 只与单一或很少种类的蛋白质等
47、生物大分子结合的配体 eg.抗原和抗体、酶和它的抑制剂通用性配体 特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体 eg.凝集素可以结合各种糖蛋白,亲和层析法,洗脱方法,特异性洗脱 利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。非特异性洗脱 通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。,亲和层析法,特异性洗脱,亲和层析法,特异性洗脱的优缺点,优点,缺点,改善方法,特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率可避免蛋白质变性,较长的时间和较大的洗脱条件,选择亲和力强的物质洗脱
48、、加大洗脱液浓度,亲和层析法,非特异性洗脱,待分离物质与配体亲和力较小 连续大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱液体积较大，待分离物质浓度较低。待分离物质与配体结合较强时 适当的pH、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性。待分离物质与配体集合非常牢固时 使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂，使蛋白质等带分离物质变性，洗脱后再复性。,亲和层析法,基本操作,亲和层析法,1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elution,Matrix,Specific ligand,E
49、quilibrate the column and the sample to binding conditions.,亲和层析法,1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elution,Target binds,Others wash out,Apply sample under binding conditions.,亲和层析法,1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutio
50、n,Target elutes,Change the eluent to elute the target.,亲和层析法,亲和层析法,亲和层析的优点只需一步纯化步骤即可使待分离物质从复杂的混合物中分离出来。产物纯度很高。可从很稀的溶液中纯化到所需物质。,亲和层析的缺点可能吸附一些杂蛋白质。洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。载体较昂贵，配基制备困难。,亲和层析的应用,目前亲和层析技术被广泛应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。,亲和层析法,生物素和亲和素,快速液相蛋白纯化系统,气相色谱仪,液相色谱仪,1.一个体积为100 mL悬浮液中有三种物质
