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1、生物化学检验技术研究进展,赵晓君,主要内容,生化检验的发展简史,1,生化检验的常规技术,2,生化检验的新兴技术,3,生化技术的临床应用,4,概念,临床生物化学是研究器官、组织人体体液的化学组成和进行着的生物化学过程，以及疾病、药物对这些过程的影响，为疾病诊断、病情监测、药物疗效、预后判断和疾病预防等各个方面提供信息和理论依据。,临床生物化学,19世纪以来，随着医学科学的发展和实验室检测需求的增加，一些化学家利用化学分析的手段实现了对人类体液、血液某些生化指标的定量分析，如血糖、尿素氮等，继之又逐渐建立了一些酶活性的测定方法，这些利用化学手段建立的用于分析患者体液、血液特定化学成分的方法对促进临
2、床医学由经验医学向现代医学转变起了巨大的促进作用，逐渐形成了一门独立的学科 临床化学(Clinical Chemistry)，国内习惯称此学科为生化检验。此学科一直延续到今天，已发展壮大为不可缺少的医学领域。,临床生物化学发展的重大突破,“临床化学”名称的由来体液生物化学组分的分析应用及“细胞内环境相对稳定”概念 比色法和光度法在临床生物化学实验室中的应用 血清酶活力测定作为细胞和组织损伤的指标治疗性药物监测成为临床生物化学的一个重要分支 超微量的仪器分析、免疫学、分子生物学、放射性同位素等技术在生物化学实验室中的应用 自动化装置和超微分析,生化检验的常规技术,一、光谱分析技术二、电泳技术三、
3、离心技术四、层析技术五、电化学分析技术,光谱分析技术,定义：利用各种化学物质(包括原子、基团、分子及高分子化合物)所具有的发射、吸收或散射光谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。根据物质对光谱响应特征的不同，可把光谱分析技术分为发射光谱分析技术、吸收光谱分析技术和散射光谱分析技术三大类。它既可以研究物质的结构，也可以对特定物质进行定性或定量分析。,分光光度法,原理：利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。应用：氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定
4、、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学的研究,层析技术,原理：层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。,分类,吸附层析分配层析凝胶层析离子交换层析亲和层析聚焦层析,离子交换层析（ion-change chromatography）,原理基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应
5、用 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与反离子进行交换,3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用,原始缓冲溶液的反离子,样品溶液,梯度浓度,亲和层析（affiuity chromatography）,应用 分离纯化酶、抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能,原理：,基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex,聚焦层析（Chromatofocusing）,该法分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋
6、白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。,层析时的聚焦效应示意图,流速,移动速率,电泳技术,原理：电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电
7、荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。,电泳技术分类（按实验装置分类）,纸电泳 薄膜电泳 凝胶电泳,毛细管电泳,垂直板凝胶电泳,常用电泳技术,一、醋酸纤维薄膜电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）1、SDS-PAGE 2、PAGE等电点聚焦 三、琼脂糖电泳 四、毛细管电泳,SDS-PAGE,原理：当SDS（Sodium Dodecyl
8、Sulfate,十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。应用:测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数,等电点聚焦,原理：在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极p
9、H值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量,离心技术,原理：离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。不同大小、形状和密度的颗粒会以不同的速度沉降。,电化学分析技术,定义：利用物质的电化学性质，测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法称为电化学分析法。原理：将电极浸入待测溶液中组成原电池，其中一支电极的电极电位与待测离子的活度有关，此电极为指示电极；另一支
10、电极是电位已知并且恒定的所谓参比电极，目前最常用的参比电极有甘汞电极和银-氯化银电极。,分类,电位法：测定原电池电动势以求物质含量电导法：测定电阻以求物质含量电容量法：借助某些物理量的突变作为滴定分析终点的指示,新兴技术,高效液相色谱分析法毛细管电泳技术生物芯片技术,高效液相色谱分析技术（HPLC),高效液相色谱法是用特制微粒（10m）充填的层析柱作为固定相，通过高压使液体流动相快速通过层析柱而达到快速有效分离液相中各种物质的层析技术。它具有分离效果好、分析速度快、检测灵敏度高等特点。在医药卫生和生物化学领域得到广泛的应用，蛋白质、糖类、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等大分子以及高分子聚合
11、物都能用HPLC测定。,典型的高效液相色谱仪包括输液系统、进样分离系统、检测系统和数据处理系统等部分。流动相用一高压泵输入，输入前要先脱气。在分离过程中按一定程序连续改变流动相的离子强度、pH和极性，以改变分离条件、提高分离效果、缩短分离时间。进样可以是注射器进样，也可以是进样阀进样。HPLC使用的检测器应用最多的是紫外或紫外-可见分光检测器，还有荧光检测器、电化学检测器等。,临床应用,高效液相色谱法是目前最好的血药浓度监测方法，但在实际应用中还存在一些问题，如每遇到一种新药必须摸索测定的最佳条件；各种药物的测定条件不同，要不断的更换流动相甚至色谱柱；每次只能测定一种药物，至多只能测定一类药物
12、，无法测定性质不同的药物。因此，高效液相色谱法用于常规血药浓度监测，只适用于少量常用的某些特定药物，大大限制了它的推广应用。,鉴于临床的需要，国外一些公司设计了自动高效液相色谱仪，具有以下优点：固定色谱柱和流动相，使一台仪器适合多种药物的检测。利用计算机技术，储存几百种药物的图谱，能自动识别未知药物。为提高图谱鉴别能力，该机利用了三维光谱、出峰时间等多种手段。自动进样系统使仪器自动定量或定性测定，分析多达50个样品。,毛细管电泳,毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75m）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的
13、检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。,原理：CE所用的石英毛细管柱,在pH3情况下,其内表面带负电,和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下,双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和,正离子的运动方向和电渗流一致,故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反,但因电渗流速度一般都大于电泳流速度,故它将在中性粒子之后流出,从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。,毛细管电泳装置示意图,发展历史,1
14、981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75m内径毛细管柱内用高电压进行分离,创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦,Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。19881989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。,与高效液相色谱法的比较,共同点：都是高效分离技术,仪器操作均可自动化,且二者均有多种不同分离模式。差异点：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，CE的分析时间通常不超过30min,比HPLC速度快；对CE而言,从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比,对扩散系数小的生物大分子而言
15、,其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级,最低可达270fl,流动相用量也只需几毫升,而HPLC所需样品为l级,流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备,而HPLC可作常量制备。,与普通电泳比较,CE和普通电泳相比,由于其采用高电场,因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外,其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。,优点,三高二少：高灵敏度：常用紫外检测器的检测限可达10-1310-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-1910-21mol；高分辨率：其每米理论塔板数
16、为几十万；高者可达几百万乃至千万,而HPLC一般为几千到几万；高速度：最快可在60s内完成,在250s内分离10种蛋白质,1.7min分离19种阳离子,3min内分离30种阴离子；样品少：只需nl(10-9L)级的进样量；成本低：只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。,毛细管电泳(CE)除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外,其仪器结构也比高效液相色谱(HPLC)简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。前三个部件均易实现,困难之处在于检测器。特别是光学类检测器,由于毛细管电泳溶质区带的超小体积的特性导致光程太短,而且圆柱
17、形毛细管作为光学表面也不够理想,因此对检测器灵敏度要求相当高。,应用,目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成寡核苷酸、DNA酶切片段及PCR产物的分析鉴定、DNA顺序测定等，在生物大分子和小分子的分离分析及临床检测等方面也有广阔的应用前景。,生物芯片技术,生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片及细胞等生物样品有序地固化于支持物，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄像机对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分
18、子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。,分类及基本原理,根据芯片上固定的探针分为：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等。另外根据原理不同，还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。基本原理：将制备好的生物样品固定于经化学修饰的载体上，然后与标记的样品分子杂交，根据各探针分子杂交信号的强度来确定样品分子的数量和序列信息。,应用,基因测序：芯片技术中的杂交测序技术是一种新的高效快速测序方法。每种疾病都有其相应的致病基因或易感基因存在，这样就能通过基因检测对疾病进行基因诊断和基因治疗。新药开发：高通
19、量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计。寻找新基因：定量监测大量基因表达水平，在阐述基因功能、探索疾病原因及机制、可能的诊断及治疗靶等方面是很有价值的。,存在问题,生物芯片技术虽然还处在初期发展阶段，但它的飞速发展正在逐步改变着人们对生物体的认识，随着这一技术的深入发展，它对于临床疾病诊断、疾病发生机制的认识和新药开发都将是一个重要的研究手段。但仍存在很多难以解决的问题，如技术复杂、检测灵敏度较低，重复性差、分析范围较窄和成本昂贵等问题。这些问题主要是表现在样品得制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。,生化技术的临床应用,临床生物化学是生物化学与临床医学相互渗透逐渐形成的一门新的学科。它主要有两个作用：第一，阐述有关疾病的生物化学基础和疾病发生发展过程中的生物化学变化。第二，开发应用临床生物化学检验方法和技术，对检验结果的数据及其临床意义作出评价，用以帮助临床诊断以及采取适宜的治疗。,主要内容,血糖及其代谢物检测血清脂质和脂蛋白检测血清电解质检测血清酶检测内分泌激素检测治疗药物监测,思考题,1.毛细管电泳技术的优点？2.生物芯片技术主要应用于哪些方面？,Thank you!,
