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1、微生物分子生态学的一些研究方法,微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容。,群落结构决定了生态功能的特性和强弱。群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。群落结构变化是标记环境变化的重要方面。,通过对环境微生物群落结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。,20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。,微生物群落结构和多样性研究方法：,在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法
2、），对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。,在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。,虽然可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态学的发展起了很重要的作用。采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少（不到1%）。Amann 等人报道在自然环境样品中可培养的微生物占总的微生物数量的比例范围从0.001%（海水）到0.3%（土壤）。不能全面地反映微生物区系组成状况
3、，烦琐、耗时。,1、传统的微生物培养法,2、群落水平生理学指纹方法(CLPP),微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)，通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性的分析方法。具体而言，CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源的利用能力，来确定哪些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。,BIOLOG鉴定系统,自动化、快速,可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝
4、状真菌。,每个孔中含有不同的底物,菌悬液或无菌水,仅能鉴定快速生长的微生物，误差较大（pH），拥有的标准数据库还不完善,在96孔细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源（95种）利用情况。干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑 微生物利用碳源进行呼吸时（产生的NADH），会将四唑从无色还原成紫色。,3、生物标记物法（Biomakers）,生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环境中提取出来，然后对提取物进行纯化，
5、后用合适的仪器加以定量测定。,优点：不需要把微生物的细胞从环境样中分离，能克服由于培养而导致的微生物种群变化，具有一定的客观性。,醌指纹法(Quinones Profiling),呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q)和甲基萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一步区分。,每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。,醌指纹法具有简单快速的特点。,磷
6、脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。,磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid,PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester,FAME）谱图分析,脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。,甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析出全细胞的FAME谱图。,脂肪酸谱图法分类水平较低，不能鉴定到种。另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可
7、靠性。,磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。,4.ERIC(肠杆菌基因间保守重复序列)-PCR指纹图谱技术,Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。,在微生物群落中，各细菌数量占1-10%时，其特征性ERIC-PCR主条带就可以在指纹图中表现出来。ERIC-PCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的多少，条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低。,分析不同环境样品中微生物混合DN
8、A的ERIC-PCR指纹图谱的差异，就可比较不同生态系统微生物群落的差异，或者同一个群落在不同功能状态下的结构变化。,E1:5-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3E2:5-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3,ERIC-PCR引物20 pmol/l,5.以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法,用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列包括：核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重复序列和随机基因组序列等。最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要指
9、标。,Diversity estimation based on molecular markers,实验原理,16S rDNA是基因组的“biomarker”核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16S rDNA广泛存在于所有原核生物的基因组中。16S rDNA的序列中包括保守区和可变区。序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应，而且一般不发生水平转移。GeneBank和RDP（Ribosomal DatabaseProject）数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释的16S rDNA序列，可供进行比对。,16S ribosomal RNA,Present in all life mo
10、lecular chronometer taxonomy(large database)evolutionone active bacterial cell:104 copies 15 rRNA genes(i.e.,rDNA)(Mycobacterium tuberculosis,Mycoplasma pneumoniae,Sulfolobus solfataricus with 1 copy,Clostridium paradoxum with 15 copies)1500 nt(enough information)four different domains conserved reg
11、ions(no variation among all life)variable regions(V1-V9),Source:Louis,B.,Gene IV,1997,环境16S rDNA文库的构建与组成分析技术,1990年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性。16S rDNA文库中的蓝藻种类与培养出来的蓝藻很不一致；发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群；与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生物多样性；这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。,构建环境1
12、6S rDNA文库的方法,用环境基因组总DNA进行16S rDNA PCR扩增：把环境中几乎所有微生物基因组上的16S rDNA扩增并收集到一起。universal primers:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3(Esherichia coli bases 8 to 27)和 5-TACCTTGTTACGACTT-3(E.coli bases 1507 to 1492)“TA克隆”：把每一个16S rDNA分子放到文库中的每一个克隆里。,阳性克隆筛选的过程：1.Amp抗性，挑选出含有质粒的克隆2.蓝白斑筛选，挑出带有插入片段的克隆3.PCR筛选，挑出带有正确长度插入片段的克隆
13、,ARDRA分型与测序,各OTU含有的克隆数量,克隆文库的统计分析,Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism(T-RFLP),16S rDNA,Liu et al.,1997,AEM,变性梯度凝胶电泳（DGGE）,变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（Temperat
14、ure gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。,原理,双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。,DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。,一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链
15、区域(melting domain,MD)和解链行为(melting behavior)。,一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区域依次发生解链。,显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个解链区域。,不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。,当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比
16、较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。,一旦DNA 片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA 片段最低的解链区域解链，部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，不同的DNA 片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。,然而，当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。,在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。,含有GC
17、夹子的DNA 片段解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。,当加了GC 夹子后，DNA 片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。,当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用PCR 扩增的16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。,通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5-端含有一段GC 夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。,由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片断，所以一般选择
18、扩增16S rRNA基因的V3区或V6-V8区。,荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization）,利用荧光标记的寡聚核苷酸探针标记16S rRNA或23S rRNA，然后进行原位杂交探测，可以在原位状态下探测特定生物细胞，并可提供部分关于形态、空间分布等方面的信息。,通过FISH技术可以解决在固定群落中微生物的分布问题。原始的生物膜和絮状污泥用多聚甲醛固定在凝胶包被的玻璃上，固定并已穿孔的细胞与荧光标记的寡核苷酸探针杂交，DNA探针就会与细胞中互补的DNA或RNA杂交；然后在荧光显微镜下就可以观察到发光的细胞，偶联的FISH在激光共聚焦显微镜下可以实现标记
19、细胞在微生物菌落三维结构中的定位。,常用荧光原位杂交探针一览表,FISH常用荧光素,10 m,Desulfotomaculum(DFMI227a)48.06 3.04%Methanosaeta(MX825)49.17 2.63%,20 m,Bacteria(EUB338 I/II/III)48.06 3.04%Archaea(ARC915)49.17 2.63%,Fluorescence in situ hybridization(FISH),Microbial community determined by Fluorescent In-Situ Hybridization(FISH),un
20、iversal gamma probe,universal specific probe 1 specific probe 2,基于16S rRNA基因的分类微阵列 高通量的分析微生物群落结构，成为检测复杂环境微生物群落结构的重要工具。lab-on-a-chip：这种 lab-on-a-chip被设计成可以分离各种微生物细胞、裂解后纯化DNA 或 mRNA，这个研究领域对于更深理解微生物的群落结构具有重要影响。,分析复杂环境微生物群落结构的方法的最近进展：,未培养微生物资源的开发：,任何微生物培养技术和培养基都不能完全再现全部微生物的自然生存环境，使用免培养技术和基因组技术，直接分离土壤系统中
21、未培养微生物DNA样品并建立相应的生态基因组库，通过高通量筛选技术进行大规模的新的重要功能基因的研究，鉴定参与污染物降解与转化、各种抗酸、抗盐、抗湿、抗旱及抗（耐）重金属毒害等抗逆特殊功能基因。我国科学加已经建立了深海样品、云南腾冲热泉，青海藏牦牛瘤胃、造纸厂废水排污口和传统堆肥未培养微生物的生态基因文库，获得了一批具有特殊性质和应用前景的淀粉酶、蛋白酶和脂酶编码基因。,生 物 圈,种类丰富多样的微生物,分离培养,大规模发酵培养,宏基因组筛选,获得产物,通过构建宏基因组表达文库，通过基于序列或酶活力筛选文库获得目的基因。缺陷：超高通量的筛选或者需具有选择标记的分析方法。进展：底物诱导基因表达筛
22、选。构建 GFP表达载体，通过 fluorescence-activated cell sorting(FACS)来筛库.宏基因组DNA克隆到gfp上游，首先排除组成表达的克隆.不发荧光的克隆在底物上生长，来筛选诱导表达gfp的克隆，这种筛选方法利用代谢基因被底物诱导表达的特性。,Screening metagenomic expression libraries,针对未培养微生物的培养技术研究,微生物不可培养的原因 培养条件 营养限制 失去生态位,模拟原位生态条件的培养技术,主体为一个垫圈，两侧用0.22um的滤膜封住，允许环境中的化学物质通过，但不允许细胞通过。在鱼缸底部倒上一层海底沉积物
23、，其上放置扩散室，加入天然海水至刚好漫过扩散室，使海水不断循环。Isolating“Uncultivable”Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment,T.Kaeberlein,K.Lewis,*S.S.Epstein*,SCIENCE VOL 296 10 MAY 2002,Accessing the uncultivated microbial majority through cultivation-based approaches,Science 2002,土壤宏基因组（Metagenome）计划
24、,把所有紧密联系在一起的土壤-生物的团聚体理解为是一个“土壤细胞”，把这一特定的土壤功能单位内全部生物遗传物质总和看成是一个基因组，即土壤宏基因组,通过宏基因组测序策略（metagenomics sequencing strategy）随机鸟枪法测序（random shotgun sequencing）重建全基因组，通过整合生物信息学理论与方法（JAZZ全基因组鸟枪法汇编程序），从基因水平上重建土壤功能单位的能量流、代谢流和信息流，描绘土壤功能团的蓝图，重新理解土壤的真正功能、微生物之间的共生、竞争和代谢等复杂网络关系、揭开土壤微生物群落的价值、揭示更高更复杂层次上的生命运动规律。,recon
25、struction of near-complete genomes of Leptospirillum group II and Ferroplasma type II,and partial recovery of three other genomes,Tyson等通过宏基因组鸟枪法测序了北加州废弃黄铁矿一个酸性（pH4.0）环境中微生物群落基因组的760万个碱基（Nature,2004），在此环境基因组中发现了2个近似完整的细菌和古细菌的基因组以及其它微生物的部分基因组。,1.045 billion bps of nonredundant sequence generated,anno
26、tated,and analyzed derive from at least 1800 genomic species,including 148 previously unknown bacterial phylotypes.identified over 1.2 million previously unknown genes,including more than 782 new rhodopsin-like photoreceptors,百慕大群岛附近海水微生物群落基因组的10.45亿碱基，包含了至少1800细菌种类的基因组，148个以前未报道过的细菌类型，并鉴定了120万个未报道的基因（Science，2004）。,谢谢！,
