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1、目的基因的克隆与基因文库的构建,目的基因,目的基因,需要克隆的DNA片段,建立高效表达系统,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,确定其表达调控机制和生物学功能,目的基因的克隆与基因文库的构建,A PCR法B 基因文库的构建法C 化学合成法,基因库（gene pool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（gene library or gene bank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库（含有全部基因）cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）,B.基因文库的构建及目的基因的筛选,基因文库
2、构建的基本战略,构建基因组文库，材料来自染色体DNA构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库。,基因组文库的构建,基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。,鸟枪法克隆目的基因,1.目的
3、基因组DNA片断的制备超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。当染色体DNA上目的基因区域的限制性酶切图谱未知时，采用合适这超声处理强度和时间，可以将切割的DNA片段控制在一定在大小范围内，其上限是载体的最大装载量，下限应至少大于目的基因的长度，否则无法在一个重组克隆中获得完整的目的基因。一般来说，原核生物的基因长度大都在2kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达100kb以上，因而将外源基因片段处理成略小于载体装载量上限的长度始终是正确的，外源DNA片段越大，后续筛选的规模越小。外源DNA片段很难完整地从重组分子上卸下。,基因组文库的构建,鸟枪法克隆目的基因,1.目的基因组
4、DNA片断的制备全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控。如采用识别序列为4个碱基对的限制性内切酶（如Alu,Mbo）部分降解染色体DNA，这些限制性内切酶的识别顺序在任何生物基因组中频繁出现，因此只要采取合适的酶解条件就可能获得大片段的DNA分子。DNA片段具有粘性末端，可以直接与载体分子拼接。,基因组文库的构建,内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。,限制性内切酶的选用原则,鸟枪法克隆目的基因
5、,1.目的基因组DNA片断的制备部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。如果染色体上DNA上目的基因的两侧含有已知的限制性内切酶识别位点，而且两者之间距离不超过载体装载量的上限，用这一（两）种限制性内切酶全酶解染色体DNA片段可能更为有利，所产生的片段呈非随机化，在某些程度上可以简化后续的重组和筛选操作。,基因组文库的构建,鸟枪法克隆目的基因,2.外源DNA片断的全克隆根据外源DNA片段的末端性质和大小确定克隆载体，一般选择质粒或DNA，受体细胞一般选择大肠杆菌。如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体。如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表
6、达型载体，受体细胞选择能使目的基因表达的受体细胞。,3.重组子的筛选与鉴定抗生素抗性筛选兰-白斑筛选PCR筛选DNA杂交筛选,鸟枪法克隆目的基因的局限性,工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构,cDNA文库的构建及目的基因的获得,1、cDNA文库的构建（1）分离提取细胞总RNA（2）mRNA与其他RNA的分离，mRNA仅占总RNA的12%，可利用mRNApoly(A)与其他RNA分开。,mRNA与其他RNA的分离,(3)以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链 mRNA纯化后，加入oligo(dT)作为引物，以提供3-OH引导
7、DNA链的合成，同时加入逆转录酶和四种dNTP，形成RNA-DNA杂合分子。,以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链,（4）cDNA第二链的合成 自身引导法 获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失,（4）cDNA第二链的合成 置换合成法 获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失,还会有一小段RNA,但不影响后续的克隆操作。,cDNA第二链的合成 引导合成法获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列,cDNA法克隆目的基因的基本战略,（5）双链cDNA的克隆平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收,cDNA法分离目的基因,差异分离将两种不同组织
8、来源的mRNA进行比较，用扣除杂交（subtractive hybridization)排除相同部分，即共同表达的那部分mRNA，选出有差异的、特异表达的mRNA，构建成的cDNA文库。因而这种程序较适用于分离克隆新基因，进而研究其生物学功能。,对已知序列目的基因的筛选,DNA探针筛选：构建的cDNA文库，每个噬菌斑或菌落中含有一个被克隆的cDNA片段。然后，利用原位DNA探针进行筛选目的基因。PCR法筛选,（6）从cDNA文库中筛选目的基因,核酸探针筛选cDNA文库目的基因,未知序列目的基因的筛选,（1）从蛋白质寻找基因 早期寻找基因的方法，对特异表达的蛋白质进行序列分析，并推测一段核苷酸序
9、列，合成DNA探针，筛选分离相应的基因。,（2）同源性序列搜索在Genebank等网站中收录了大量DNA序列的数据，用同源性比较工具Blastn软件，搜索基因之间存在着的一些保守序列，可以判断某些新基因的存在。,未知序列目的基因的筛选,（3）差示筛选组织特异的cDNA是利用一对组织基因表达的差异，筛选出其中一种组织中受某种因素调控表达的一种或一组基因。制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。,未知序列目的基因的筛选,（4）DNA微列阵技术筛选基因把某一生物体内全部已知基因分别点到DNA芯片上，再用不同发育阶段的cDNA
10、与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达情况。建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出 标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针 与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活-基因诊断。,未知序列目的基因的筛选,（5）用抗体筛选目的基因 cDNA应克隆在表达载体中表达载体有使外源基因表达的必要调控部分。如启动子、SD序列等。通过表达产物与抗体特定的结合来识别和分离目的cDNA克隆。,未知序列目的基因的筛选,用抗体筛选目的cDNA克隆,cDNA法克隆目的基因的局限性,并非所有的mRNA分子都具有polyA结构细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离
11、纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因,化学合成法的基本战略,全基因合成a.小片段粘接法根据目的基因全序列，将目的基因分成若干12-15碱基长的小片断，两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片断。容易在退火时发生错配,化学合成法的基本战略,b.补钉延长法将目的基因的一条链分成若干40-50碱基的片断，另一条设计成与之交错互补的20个碱基小片段。,c.大片段酶促法根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段，拼接模块数大幅度减少，适合较大的基因合成。,化学合成法的基本战略,化学合成法的基本战略,上述三种方法各有利弊化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。,DNA化学合成的用途,合成天然基因 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等修饰改造基因 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等设计新型基因制备探针、引物、接头,
