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1、亲 和 层 析Affinity Chromatography（AC）,一、原理,生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。,酶：基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗原，病毒，细胞DNA：互补DNA或RNA，组蛋白，核酸聚合酶，结合 蛋白激素或药物：受体，载体蛋白细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞,常见具有专一性亲和力的生物分子对：,Some definitions in affi
2、nity chromatography,Matrix(基质或载体):an inert gel to which a ligand can be coupledLigand（配基）:a component which interacts specifically with the targetCoupling（偶联）:covalent attachment of the ligand to the matrixBinding（结合）:association between the ligand and the target固相化(Immobilise),固相化将配体以共价键连接于载体上制成亲和吸
3、附剂,载体的排斥效应小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基结合载体的空间障碍载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。需加碳氢链“手臂”，长度需适中。,二、亲和层析分离过程,1、装柱和平衡2、上样、亲和吸附3、洗脱,无效洗脱,吸附效率不高,有效吸附,影响吸附的因素 1、缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。2、流速尽可能慢，10ml/cm2.小时 3、上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml.4、上样体积取决于亲和力，低则上样量减少，一般柱床体积的5。,洗脱方法（1）非特异性洗脱法：非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分
4、离物质洗脱下来。比较经济，较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性。a当待分离物质与配体亲和力较小时：一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。b较强时：梯度洗脱，连续改变缓冲液浓度，使洗脱能力逐渐加强 c、非常强时：强的酸、碱或加入脲、胍等变性剂使蛋白质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。,（2）特异性洗脱法：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱：竞争对配体的结合，这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，待分离物质被取代并洗脱。例如：用单糖洗脱与凝
5、集素结合的糖蛋白另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱：,已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。再生步骤：起始缓冲液重复平衡一次用高离子强度和低离子强度溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理,4、亲和柱的再生：,三 载体（基质）的选择,1、载体要求：有丰富的可供活化的化学基团，并在温 和条件下能与配基共价结合。惰性的，非专一性吸附无或足够小。多孔网状结构。良好的机械性能，具有好的液体流动性。有较好的物理和化学稳定性。,2、常用载体 一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。（1
6、）纤维素 优点：来源丰富，可供偶联基团较多，偶联后基团又能突出在载体外缺点：结构不均匀，使偶联上配基浓度不一，非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化,（2）葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺优点：化学及物理性质稳定，可用强碱除去非特异吸附杂质。缺点：孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低。,（3）多孔玻璃 优点：不受微生物的侵蚀，机械强度好，化学稳定性好 缺点：但它可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。,（4）琼脂糖凝胶 非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用。商品名：Sepharose型号：2B，4B，6B型号含义
7、：琼脂糖浓度为2%，4%，6%因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。,四 配基的选择,1、配体与待分离的物质有适当的亲和力。2、配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。3、配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对配体与待分离物质亲和力没有明显影响。,4、配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。,三、亲和层析的优缺点,1、只需一步纯化步骤，非常简单2、产物非常纯95%,3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、还
8、可去除已变性或部分降解物质5、但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制6、载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化,四、应用,1、分离和纯化2、分辨化学或遗传学上修饰的酶3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构研究4、纯化人工合成的多肽和蛋白质5、解释酶作用机理,Ixv_2 JB 980910,21,Ion Exchange Chromatography,Useful at all stages of purification and at all scales,一、原理,离子交换层析是用离子交换剂（具有离
9、子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离离子型混合物的层析方法。,离子交换树脂如何分离蛋白质,洗脱,树脂,与树脂结合力,二、离子交换剂的类型,在惰性载体上引入带有电荷的活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂带正电荷，与阴离子交换 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。,胶体,胶体,阳离子交换基,强酸性，聚苯乙烯树脂,弱酸性，羧甲基纤维素,弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂,阴离子交换基,强碱性，聚苯乙烯树脂,弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素,离子交换树脂离子交换纤维素离子交换凝胶,（二）按载体种类不
10、同,1.离子交换树脂：聚苯乙烯树脂：,苯乙烯,二乙烯苯,母体,交联剂,离子交换树脂的性质,1、一般离子交换剂的特性多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂稳定性：离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团,Dowex 100 149m Dowex 50 297mDowex 20 840m,2、交联度：合成树脂时所用的交联剂在原料总重量中所占的百分比交联度越大 树脂的网孔越小 膨胀性小 交换量少交联度越小 树脂的网孔越大 膨胀性大 交换量大 膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损,阳离子交换树脂 强酸型 磺酸基-SO3-H+中等酸型 磷酸根-O-PO2H2 亚磷酸根-
11、O-POH2 弱酸型 羧基-COOH阴离子交换树脂 强碱 季胺基团-N+(CH3)3 弱碱 叔胺、仲胺、伯胺基团,可引入的解离基团,离子交换树脂对离子的亲和力,阳离子树脂电价数：Na+Ca+Al+Ti+原子价数相同，原子序数 Li+Na+K+Pb+阴离子强碱性交换树脂CH3COO-F-OH-HCOO-CL-SCN-Br-CrO4=NO3-I-C2O4=SO4=弱碱性交换树脂F-CL-Br-=I-=CH3COOMo4=PO4=NO3-酒石酸根柠檬酸根C2O4=SO4=OH,操作过程：1.装柱；2.离子交换；3.洗脱,三、离子交换剂与缓冲液的选择,（一）离子交换剂的选择必须考虑的影响因素 1阴、阳
12、离子交换剂的选择2强、弱离子交换剂的选择3不同离子型交换剂的选择4不同基质离子交换剂的选择,阴、阳离子交换剂的选择,测定pI确定稳定pH范围 碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c 酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCG,离子交换剂的选择图,不同离子型交换剂的选择,选用何种类型离子交换剂?-取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。,不同基质离子交换剂的选择,1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素,1、
13、缓冲液pH的选择 2、缓冲液离子组成的选择3、缓冲液离子强度的选择,（二）缓冲液的选择,1、缓冲液pH的选择,要求：起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来。PH值与目标物pI的关系（pH=pI1）选用弱阳离子交换剂时，pH高于其pK；选用弱阴离子交换剂时，pH低于其pK；,2、缓冲液离子组成的选择,采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如：Tris缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度。,3、缓冲液离子强度的选择,起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，一般小于0.1mol
14、/L。洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般0.15mol/L（或采用pH洗脱）。,原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱,(三)洗脱剂,四、应用,适用于 分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子。,五、离子交换层析的优点,应用范围广：20种氨基酸中，大部分带正电或负电。处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多。去除杂质能力强，如对核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及电荷性有差别的蛋白均可去除。分离能力强。可放在纯化工艺的任何一步。,Hydrophobic int
15、eraction chromatography（HIC）,疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类 是一种通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法。,一、疏水层析的原理,不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。,（一）疏水作用,蛋白质与固定相结合原理,蛋白质表面存在的疏水补丁蛋白质发生（局
16、部可逆性）变性时，原本隐藏于分子内部的疏水残基暴露至分子表面疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水残基容易与疏水性固定相结合,洗脱原理,通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐渐洗脱）,（二）吸附剂,根据基质的性质不同分为：,1.亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖（Sepharose）,配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统,2.非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合特点
17、：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适用于高压层析（如HPLC等）,二、操作,1.制备层析柱2.加样与洗脱3.层析柱再生,57,Equilibration,1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.Elution,Equilibrate the column and adjust the sample to binding conditions,Hydrophobic ligand,Gel matrix,Water molecules,58,Sample application,1.Equilibration2.Sample appli
18、cation3.Washing4.Elution,Gel matrix,59,Washing out unbound material,1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.Elution,Non-bound proteins,60,Elution,1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.Elution,Target elutes,Conc.salt,Abs,61,Elution,Conc.salt,Abs,1.Equilibration2.Sample application3.Wash
19、ing4.Elution,More strongly bound proteins,样品的准备：,往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与平衡液基本一致，并调节样品溶液的pH使其满足吸附条件。HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样,洗脱的方式：,采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；通过往流动相中添加有机溶剂，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱（溶剂中稳定性良好的物质）往流动相中添加去污剂等，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）,洗脱理论：,疏溶剂理论：1976年由
20、Sinanoglu等人提出，认为由于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾向，而增加了与疏水配基结合的概率。自由能分离理论：1979年Vanoss等人提出，认为生物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力，这个引力随溶液盐析能力的改变而改变。熵分离理论：1984年Regnier提出，认为高盐溶液中，蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水部分易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度，表面水分子被排斥开，使体系熵增加。,三 介质的选择,基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质；近年来研制超大琼脂糖(superp
21、orous)，在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好的分辨率；壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来在疏水层析中也得到了应用。,层析介质的再生、贮存：,再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微生物钝化失活起到消毒的效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的清洗剂。贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微生物的生长。,HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。,四 配
22、基的选择,偶联至基质的常见配基类型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基,对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。,常用商品化疏水层析介质,Octyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml50mol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的
23、最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml 50mol 正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。,Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水性强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，配基结合量为每ml40mol，苯基Phenyl，工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h。Phenyl Sepharose CL-4B 疏水性较正辛烷基弱，适用于分离和纯化对疏水性尚未了解的蛋白，配基结合量为每ml40mol苯基Phenyl；工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是50cm/h。,五 疏水层析的影响因
24、素1、盐类和盐组成流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的吸附能力具有最为重大的影响。选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。,2、离子强度 离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留值。一般增加离子强度来增加组分的保留值，降低离子强度来提高组分的解析附能力。HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般宜采用梯度洗脱法，可提高分离的选择性。3、溶液的酸碱度 溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点，其疏水性增加，有利于与固定相配基相互作用；远离其等电点，其
25、疏水性减少，不利于与固定相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。,4、柱温 一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。,六、疏水层析的优点,1、原则上可用于所有蛋白质纯化，处理量大，特别是从大体积样品中提取低含量的目标蛋白显优势2、对DNA及小牛血清(其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分)去除率较高，尤其是对细胞DNA一步去除率可达90以上3、一般放在纯化工艺的最前面。4、条件温和，不易使蛋白变性。5、可用于蛋白的浓缩。6、在纯化方案中，疏水作用层析可以用于样品的捕获、中度纯化、精细纯化。,各种层析的效果对比：,IEC 离子交换层析AC 亲和层析,作业：绘制某一蛋白的纯化流程图要求：1、注明每一步的纯化条件和纯化方法。2、必须包括粗分级分离和细分级分离（层析）两个步骤。3、A4纸双面打印,
