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1、蛋白质分子质量测定方法概述,皇家药院,目录,SDS-PAGE凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是实验室进行蛋白质研究中最常用的技术，兼有电泳和分子筛的双重作用。SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性，与其蛋白质结合成带负电荷的蛋白质-SDS复合体，消除电泳过程中蛋白质所带电荷对电泳结果的影响，从而保证蛋白质电泳仅受分子质量大小的影响。在一定的电场作用下，该复合体沿着以聚丙烯酰胺凝胶形成的分子筛向电场的正极移动，从而将蛋白质根据他们的分子量大小而分开。蛋白质-SDS复合体：形状一定、电荷密度一定,SDS-PAGE凝胶电泳,上样：防止样品溢出、正负极、电压,SDS-PAGE凝胶电泳,当蛋白质分子量
2、在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-bRf+K其中，MW为蛋白质分子质量，Rf为相对迁移率，b为斜率，K为截距，当条件一定时，b和K为常数。因此通过已知分子量的蛋白和未知分子量蛋白的比较，就能得出未知蛋白的分子量。,影响分子量测定的因素很多，包括蛋白质与SDS的结合量的不同，凝胶浓度和交联剂浓度等，如图所示。研究者测定了当交联剂浓度不变，改变凝胶浓度，下图分别对应于凝胶浓度为5%，10%，15%。,SDS-PAGE凝胶电泳,优点：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好。缺点：对于电荷异常或者构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白及一些
3、结构蛋白测定的分子质量不太可靠，而且电泳结束后还需要染色，染色，脱色比较耗时。,SDS-PAGE凝胶电泳,凝胶渗透层析法,定义：又叫体积排阻层析、分子筛层析，当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行的分离技术。固定相：惰性凝胶颗粒，颗粒内部立体网状结构，形成许多孔穴原理：,凝胶渗透层析法,常用凝胶：交联葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶（Sepharose）,凝胶渗透层析法,洗脱体积Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1K2logMW（K1、K2为常数，MW为分子量）从公式可以看出，目标样品的流出体积与分子量对数成线性关系。在实际操作过程中
4、，选取标准品与样品同时通过凝胶柱，通过已知标准品的流出体积和分子量可以计算出曲线中的K1、K2值，再根据已知的曲线方程和样品流出体积计算样品的分子量。,凝胶渗透层析法,优点：操作简单，设备简单，样品用量少，周期简单，条件温和，一般不引起生物活性的改变。缺点：应用具有一定的局限性，在pH68的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。,质谱法,1906年，Thomson发明了质谱技术，最初只是用于无机化学中的同位素分析，直至20世纪40年代末才发展成为有机质谱。近年来，生物质
5、谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以分别由美国科学家和日本科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）及基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。可准确测定分子量,1.电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）,原理：电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷密度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群，通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子
6、量，由于ESI-MS可以产生多电荷峰，因此使得测试的分子质量范围大大扩大。,1.电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）,电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源,1.电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）,多电荷使得样品谱图复杂荷质比：,1.电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）,优点：（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；（3）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳、高效液相色谱等，是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。缺点：对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得
7、结果分析较为困难。,2.基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）,原理：基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。将它与经典的脉冲化工作方式的飞行时间质谱仪（TOF）直接联用，即我们常听到的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。,2.基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）,优点：（
8、1）同ESI-MS 一样对样品的消耗很少；（2）MALDI-MS 的最高分辨率不断提高，甚至超过ESI-MS；（3）有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；（4）MALDI-TOF 质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广。缺点：在与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备的联用时，目前只能采取离线的方式，致使分析结果的重复性较差，与MALDI-MS 本身高精密度的特性不匹配。,其他方法,除了以上几种目前实验室常用的测定方法，还有一些现在在实验室一般不太使用的方法，包括粘度法，渗透压法，辐射失活法，超速离心沉降法，光散射法等。,1
9、.粘度法,粘度法是指通过测定样品溶液的粘度，从而计算样品的的分子量的方法。一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。特性粘度与相对分子量M之间遵循Mark-Houwink经验方程：=KM。K和值与温度、聚合物、溶剂性质有关，也和分子量大小有关。,2.渗透压法,在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。渗透压法测定蛋白质分子量灵敏度
10、较低，测定误差较大，与SDS-PAGE法和凝胶色谱法等相比不常用于蛋白质分子量的测定。,3.辐射失活法,辐射失活法无需纯化和溶解蛋白质，可在原位测定其分子量。高能射线照射生物组织会产生电离作用，若在一定范围内辐射能量破坏蛋白质分子的C-H键，使蛋白质丧失功能，电离作用减少。D：辐射能量辐射失活法作为一种独特的蛋白质分子量测定方法，具有独特的优点，尤其是在膜蛋白研究方面，提供了一个测定膜蛋白分子量和研究其结构的手段，但由于高能射线使用的局限性，在生化研究中不常用。,4.超速离心沉降法,利用超速离心沉降法测蛋白质的分子量是在较低转速下进行的（8000-20000r/min）。离心开始时，分子颗粒发
11、生沉降，一段时间以后，沉降的结果造成了浓度梯度，因而产生了蛋白质分子反向扩散运动，当反向扩散与离心沉降达到平衡时，浓度梯度就固定不变了，但是目前由于操作繁琐，已经不在一般实验室使用。,5.光散射法,主要基于染料阴离子在蛋白质等电点前与肽链上带正电荷的基团上的结合作用。此时生色团聚集于蛋白质分子上引起共振散射光增强，它与核酸不同的是生色团必须是带负电荷的阴离子。,结束语,蛋白质分子量是有机化合物最基本的理化性质参数。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。分子量也是多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数，也是基因工程产品报批的重要数据之一，在实验过程中，要根据蛋白质本身的性质特点，选择合理的测定方法对蛋白质进行分子质量的测定。,
