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1、1,蛋白质化学选修课 第二章 蛋白质组成和结构,本章主要内容：蛋白质分类、氨基酸、蛋白质的结构、蛋白质结果与功能的关系,2,第一节蛋白质的分类,1.根据蛋白质分子形状2.根据分子组成3.根据蛋白质溶解度分,3,根据蛋白质分子形状,可分为 球状蛋白质 和 纤维状蛋白质球状蛋白质分子 球状或椭圆状，溶解度较大，能结晶，在生物体液和细胞中的蛋白质大多属于这一类型。纤维状蛋白质分子 类似细棒或纤维，它们又可分为可溶性纤维蛋白和不溶性纤维蛋白，前者如血纤蛋白、肌肉中的结构蛋白等，后者如胶原、弹性蛋白、角蛋白等。,4,简单蛋白质 和 结合蛋白质 二大类。简单蛋白是指其分子中只有氨基酸组成的多肽链。结合蛋白
2、是指具有生物活性的蛋白质分子组成中除了氨基酸多肽链外，还含非氨基酸成分，生物体内大部分蛋白质属于此类，核蛋白 由蛋白质和核酸组成，如鱼精蛋白、小麦芽中核精蛋白等；糖蛋白 是蛋白质与糖的结合物，在生物膜上、某些酶类和动物血浆中大多数蛋白质均是糖蛋白；,2.根据分子组成可分为：,5,脂蛋白 由蛋白质和脂类通过非共价键相连而成，广泛存在于生物膜和动物血浆中。色素蛋白 如血红蛋白、叶绿素、细胞色素类等。磷蛋白 由蛋白质和磷酸组成，磷酸往往与丝氨酸或苏氨酸侧链的羟基结合，如胃蛋白酶、乳中酪蛋白。黄素蛋白 则是蛋白质与黄素腺嘌呤二核苷酸，黄素但核苷酸的结合物，如琥珀酸脱氢酶。,6,7,3.根据蛋白质溶解度
3、分,清蛋白 一般指溶于纯水或稀盐溶液中、加热易凝固、不溶于饱和中性盐溶液中的蛋白质。球蛋白 指不易溶于水，可溶于稀盐溶液，不溶于饱和或半饱和的盐溶液；加热不全部凝固的一类蛋白。醇溶蛋白 则不溶于水及盐溶液，但溶于70%-80%的乙醇中。谷蛋白 指不溶于水和中性盐，只溶于稀酸稀碱溶液的一类蛋白。硬蛋白 如角蛋白、胶原蛋白，如动物的毛、发、角、爪、筋、骨等，它们只能在强酸、强碱溶液溶解。,8,第二节 蛋白质的元素组成,蛋白质分子中主要的元素组成是：C：5055、H：6.07.0O：2023N：1516S：0.32.5其中N元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于6.25克蛋白质。,9,微量凯
4、氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量消化：有机物浓H2SO4(NH4)2SO4CO2蒸馏：(NH4)2SO4NaOHNa2SO4NH3H2O吸收：NH3H3BO4 NH4H2BO4滴定：H2BO4HClH3BO4 Cl,10,凯氏定氮法注意事项,图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a消化装置 b蒸馏吸收装置,1、硫酸钾 及硫酸铜的作用2、火候控制3、装置的气密性4、何时加碱5、难消化的 对策6、停止蒸馏,11,说明及注意事项,所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮损失.消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷
5、凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫。,12,当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23mL后再继续加热消化。若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量（何时会必要？）。一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。,13,蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化
6、钠用量。硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,14,凯氏定氮法是我国国标中规定的测定蛋白质含量的方法。若被测样品中的氮全是蛋白氮，则计算所得为真蛋白的含量，否则计算值为粗蛋白含量。不同蛋白质蛋白系数）略有差异。,思考题：假奶粉的特点及其辨别,15,第三节 蛋白质的分子组成-氨基酸,组成蛋白质的基本单位是氨基酸（amino acid）。如将天然的蛋白质完全水解，最后都可得到约20种不
7、同的氨基酸。这些氨基酸中，大部分属于L-氨基酸。其中，脯氨酸属于L-亚氨基酸，而甘氨酸则属于-氨基酸。,16,17,一、氨基酸的结构和分类：,蛋白质水解后得到的氨基酸都是 氨基酸,天然产氨基酸（除甘氨酸）都有旋光性，绝大多数为L构型，（少数微生物代谢产物是D构型）,用 R、S 命名的则 L 构型的氨基酸多为 S 型，只有L半胱氨酸为 R 型。,18,氨基酸的分类,1.根据R侧链基团解离性质的不同，可将氨基酸分为三大类：中性氨基酸 侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电荷。酸性氨基酸碱性氨基酸,19,非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,（二）氨基酸的分类,分类依据：R侧链基
8、团的结构及理 化性质的不同,20,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,21,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨
9、酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2.极性中性氨基酸,22,侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷。,3.酸性氨基酸 Glu，Asp,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,23,4.碱性氨基酸 His，Arg，Lys,侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷。,组氨酸 His（H）7.59,赖氨酸Lys（K）9.74,精氨酸 Arg（R）10.76,24,另
10、外：,1、蛋白质中的很多氨基酸是经过加工修 饰的修饰氨基酸 如：脯氨酸 羟基化 成 羟脯氨酸 赖氨酸 羟基化 成 羟赖氨酸2、半胱氨酸Cys常以胱氨酸的形式存在,25,半胱氨酸,胱氨酸,26,结构 名称 缩写 等电点,I、中性(*为必要氨基酸，人体内不能合成，只能从食物中得到）,NH2CH2COOH,丙氨酸 Ala 6.00,*缬氨酸 Val 5.96,*异亮氨酸 Ile 5.98,甘氨酸 Gly 5.97,27,结构 名称 缩写 等电点,*亮氨酸 Leu 6.02,*苯丙氨酸 Phe 5.48,半胱氨酸 Cys 5.07,*苏氨酸 Thr 5.6,谷氨酰胺 Gln 5.56,天冬酰胺 Asn
11、 5.07,28,结构 名称 缩写 等电点,*蛋氨酸 Met 5.47,丝氨酸 Ser 5.68,脯氨酸 pro 6.30,酪氨酸 Tyr 5.66,*色氨酸 Trp 5.89,29,结构 名称 缩写 等电点,II 酸性,天冬氨酸 Asp 2.77,谷氨酸 Glu 3.22,III 碱性,*赖氨酸 Lys 9.74,精氨酸 Arg 10.76,组氨酸 His 7.59,30,2.若根据 R 的化学结构不同 可分为：,（1）脂肪族氨基酸：疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、
12、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro,31,3.若根据氨基酸的营养特性,必需氨基酸：赖、蛋、亮、异亮、苯丙、色、缬、丝氨酸（8种）；精、组氨酸。非必需氨基酸限制性氨基酸非限制性氨基酸,32,二、氨基酸的理化性质：,1.一般物理性质（1）熔点很高-氨基酸为无色晶体，熔点超过200，个别超过300。许多氨基酸在达到熔点或接近熔点时，或多或少地发生分解，因此熔点不明显。氨基酸的熔点比一般有机化合物高的多，主要原因是氨基酸在晶体时也以两性离子的形式存在，类似于无机盐化合物。(2)水中溶解度差别较大（极性和非 极性），不溶于有机溶剂。(3)有不同味道；,33,2两性解离及等电
13、点：氨基酸分子是一种两性电解质。通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解离状态发生改变。氨基酸分子带有相等正、负电荷时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（Isoelectric point,pI）。,34,溶液pH值与氨基酸等电点的关系,35,氨基酸等电点的确定：,1）酸碱滴定（滴定曲线）2）根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。,说明：(1)等电点为电中性而不是中性（即pH=7），在溶液中加入电极时其电荷迁移为零。(2)等电点时，偶极离子在水中的溶解度最小，易结晶析出。,36,由此可知:等电点相当于该aa两性离子状态两侧 基团pK值之和的一半。,A、
14、对侧链R基不解离的中性氨基酸：pI=1/2（pK1+pK2）即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。,37,B、对有三个可解离基团的氨基酸：,如：酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算：a、先写出其解离公式；原则：所有羧基先于氨基解离；羧基优先；氨基先于其它氨基解离。b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平 均值。,38,如：天冬氨酸,39,如赖氨酸：,40,3紫外吸收性质：天然蛋白质分子的20种氨基酸，在可见光区没有光吸收，在远紫外光区（220nm均有吸收；在近紫外外光区，只有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸均有吸收光的能力，其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。因为它们的R基
15、含有苯环双键共軛系统。以色氨酸和酪氨酸对紫外光有较强的光吸收。,41,光吸收性,三种氨基酸最大吸收波长和摩尔消光系数分别为：酪氨酸 max275nm,2751.4103；苯丙氨酸 max257nm,2572.0102；色氨酸 max280nm,2805.6103；蛋白质因含有这些Aa，所以也有紫外吸收能力，不同蛋白质中这些Aa的含量不同，消光系数不完全相同。可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。,42,4。氨基酸的化学性质（1）茚三酮反应：氨基酸可与茚三酮在微酸性溶液中共热缩合产生蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。可用于氨基酸的含量测定
16、。可利用此性质测定氨基酸的含量。几个微克就能显色。,43,44,（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法,45,（3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应,DNP-氨基酸，黄色,46,用萘磺酰氯取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高,47,（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,pH8.3,无水HF,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”Edman反应,48,(5)与邻苯二甲醛反应（OPA）,在-巯基乙醇(MCE)存在下，邻苯二甲醛(OPA,o-Phthaldialdehyde)与游离氨基酸迅速反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚，此加成物具有荧光，从而利用荧光光度法测
17、定游离氨基酸总量。激发波长EX为330nm、发射波长EM为470nm OPA最早是被作为柱后衍生试剂而引进的,后来也逐渐应用于柱前反应中,49,三、氨基酸的分离分析和鉴定,1。纸层析纸层析是分离鉴定氨基酸混合物的常用技术，被测样品点在滤纸的下端，滤纸垂直于底部盛有少量可溶解被测物的混合展开溶剂的层析皿中，展开溶剂便沿着滤纸向上展开。滤纸纤维素吸附的水是固定相，展层剂是流动相。,50,51,2。薄层层析 该方法是把吸附剂或支持剂(如硅胶、氧化铝、硅藻土等无机物)涂布在玻璃板上成为一薄层。其优点是灵敏度高(比纸层折高10100倍)、分离快(一般为几到几十分钟)、显色方便(可用腐蚀性显色剂)、操作方
18、便、设备简单。,52,3。离子交换树脂法广泛用于氨基酸分离分析的柱层析法。离子交换树脂是水不溶性高分子化合物，一般制成球形颗粒。它由具网状结构的高聚物作基质，再通过化学反应引入酸性或碱性基团。被引入的酸性基团如一SO3H(强酸型)或一COOH(弱酸型)可解离出H离子，与溶液中其它的阳离子交换，因而该树脂被称为阳离子酸性树脂。若树脂含有碱性基团如一N(CH3)OH(强碱型)或NH3OH(弱碱型)时，可解离出OH，能和溶液里的阴离子交换，该树脂叫阴离子碱性树脂。,53,54,氨基酸分析仪工作流程图,55,蛋白质的氨基酸组成分析,56,57,1.高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物
19、质和生物活性物质。2.由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器和荧光检测器是HPLC仪的最常的检测器。故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。3.氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于氨基酸自动分析仪，如前文所提的茚三酮反应。4.在氨基酸的HPLC测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这是因为比起柱后衍生法它的优点有：（1）固定相采用C18(反相色谱)，可分辨分子结构细小的差异；（2）流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；（3）一机多用。,AAs assay by HPLC,5
20、8,四、氨基酸的制备（有三种方法）,1蛋白质水解法 蛋白质经过酸、碱或多种酶水解可得到各种氨基酸，再用适当的方法分离、提纯即可得到所需要的氨基酸。（1）酸水解将蛋白质与约10倍体积25硫酸或30盐酸在100左右温度下加热1240小时，即可将蛋白质完全水解为-氨基酸，若加压水解所需时间更短。此水解法色氨酸被破坏，谷氨酰胺和天门冬酰胺分别水解为谷氨酸和天门冬氨酸并释放出NH4+。工业上用毛发生产胱氨酸、面筋蛋白生产味精及化学酱油等均是依据这一原理。,59,（2）碱水解法一般用NaOH或Ba(OH)水解10小时以上。此法水解使所有的氨基酸发生外消旋作用，且半胱氨酸、丝、苏、精氨酸等受到破坏。（3）酶水法条件温和。因酶的水解专一性，无法将蛋白质完全水解成氨基酸。多种酶的联合催化可以完全水解蛋白质，但经济上不合算。2化学合成法 用有机合成法得到的氨基酸均是外消旋产物，且D型和L型氨基酸的分离在技术上难度很大。3微生物发酵法 发酵法生产氨基酸具有多快好省的优点。目前产量最大的是谷氨酸、赖氨酸，和蛋氨酸的生产。,60,思考题,1.根据奶粉掺假特点，从生化技术角度谈谈 如何设定奶粉质量指标，并采取何种分析方法 以有效避免假奶粉的出现？2.测定溶液中氨态氮的方法有哪些？各依据什么原理？3.蛋白质酸水解产物可用于酱油生产。请了解国家的有关规定。,
