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1、第六章 蛋白质的分离、纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质,蛋白质中的功能团 末端NH2 末端COOH 侧链基团所以，蛋白质的化学物理性质AA,A蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。B蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。C结合蛋白质 辅基成分包含可解离蛋白质D末端-COOH,-NH2E蛋白质分子中可解离基团的pK和游离AA中相应基团的pK值完全不相同。在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响F蛋白质可看作一个多价离子,蛋白质等电点-在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点,等离子点-没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基
2、团结合的质子数相等时的pH称等离子点。特征常数。,二蛋白质分子的大小与形状,利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量,利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量,蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率,这样造成两个后果：,SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。改变了蛋白质单体分子的构象。,SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系,(七)毛细管
3、电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（CE）则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。,(八)质谱测定蛋白质分子量 质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（ESI）可以测5万Da的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmol）量的蛋白质，精确度为0.01%。,三蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀,1蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。分散程度-胶体系统
4、分散相质点-真溶液（质点是分子，均相系统）,分散程度-以分散相质点的直径来衡量 根据分散程度：,分散相质点在胶体系统中保持稳定需三个条件：,a 分散相质点1-100nmb 分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀c 分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层,蛋白质：,a.胶体质点的范围 c 丁达尔效应d 布朗运动e 不能透过半透膜,2蛋白质的沉淀,沉淀蛋白质的方法：,盐析法：中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）蛋白质脱去水化层优点：不引起蛋白质变性 有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 条件：低温操作 缩短时间,重金属盐
5、沉淀法,当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)生成沉淀用途：抢救误服重金属盐的病人,生物碱试剂和某些酸类沉淀法,生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂 当溶液pHpI时,蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂,酸根负离子反应沉淀用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质,加热变性测定法,原因：a 加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层b 蛋白质处于等电点破坏了带电状态。用途：制豆腐（加热+少量盐卤）,四 蛋白质分离提纯的一般原则,蛋白质提纯的总目标-增加制品纯度或比活性、几增加单位蛋白质质量中所要蛋白质的含量或生物活性。,前处理：,材料
6、获得：,（一）天然材料：新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。e.g.钙调素：动物的脑组织，植物花粉 胰蛋白酶抑制剂：大豆种子 溶菌酶：鸡蛋清 抗体：血清（二）基因工程产物：对于天然不易得到的蛋白，通过工 程菌或工程细胞表达而获得。,粗分离,蛋白质混合提取液盐析法、等电沉淀、有机溶剂所要蛋白质与其他杂蛋白质分开特点：简便、处理量大、既能除去大量杂，又能浓缩蛋白质溶液。,粗分离,（一）破细胞动物，植物细胞：匀浆，研磨大肠杆菌：冻融，超声，溶菌酶,（二）抽提 1.pH：选择合适pH的缓冲液，如Tris，磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白在此pH条件下稳定。一般缓冲液浓度为2050mM。
7、2.温度：低温如410，蛋白酶活性较低。3.离子强度：如0.10.2 M NaCl或KCl.4.其他成分：还原剂如NaHSO4，维生素C；巯基保护剂DTT，巯基乙醇；金属螯合剂EDTA，EGTA；蛋白酶抑制剂PMSF。,（三）初步分离 1.分离细胞器：离心，超离心 2.除核酸：酶法DNase,RNase；超声 3.除脂肪：丙酮，脂肪酶（四）粗分蛋白 1.盐析：NaCl，(NH4)2SO4沉淀 2.有机溶剂抽提：甲醇，乙醇，丙酮 3.等电点沉淀：除去杂蛋白 4.热变性：除去杂蛋白（五）除盐 1.超滤 2.凝胶过滤 3.冻干,细分离,结晶：本身伴随着一定程度的提纯重结晶：可除去少量夹杂的蛋白质蛋白
8、质纯度愈高、溶液愈浓就愈容易结晶,五 蛋白质混合物的分离方法,(一）据分子大小不同的分离方法,1透析和超过滤 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。,超过滤 利用压力或离心力，强行使水和其他小分子通过半透 膜，而蛋白质留在膜上。,2 密度梯度（区带）离心,原理,3 凝胶过滤,（凝胶过滤层析，分子排阻层析）（分子筛层析，凝胶渗透层析）-根据分子分离蛋白质混合物,凝胶过滤的介质,常用介质：(1)Sephadex:(交联葡聚糖)G25,G50,G75,G100 Bio-gel:(聚丙烯酰胺)P-6，P-30，P-60，P-100 Sepharose:(
9、琼脂糖)2B,4B,6B(2)Sephacryl:S100,S200,S300(3)Superose:HPLC(4)superdex:HPLC,凝胶珠-多孔的网状结构交联度or孔度（网孔大小）决定凝胶的分级范围，即能被该凝胶分离开来的蛋白质混合度的分子量范围。排阻极限表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子量的分子量。,凝胶粒度-筛眼（目）数，珠直径表示 与洗脱流速，分辨率有关,凝胶过滤的原理,当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外。随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度的自由出入
10、凝胶珠的内外。,不同分子大小路径不同 大分子-先洗脱出来小分子-后洗脱出来,有关凝胶柱体积的术语,Vt为凝胶柱床的总体积（total volume），常称柱床体积。它可以用水直接测量或按几何形状计算而得。Ve为某一溶质组分的洗脱体积（elution volume）。它是自加样开始到该组分的洗脱峰或洗脱峰上升边缘的半高点出现使所流出的体积。,V0为孔隙体积（void volume）或称外体积（outer volume）或外水体积。测定不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖（blue dextran，分子量约200 000）的洗脱体积可以决定V0。直径均匀的刚性球形颗粒的柱床V0约等于0.35Vt
11、。Vi为内体积（inner volume）或称水体积，它可由于胶克重乘其吸水值（以毫升/克表示）近似地表示，或直接测出凝胶柱小分子物质（如T2O，tritium oxide）通过的洗脱体积再减去外体积得来。,Vm为凝胶基质体积（matrix volume）。凝胶床内各种体积之间的关系是：Vt=V0+Vi+Vm 其中，（Vi+Vm）亦即（Vt-V0）是凝胶珠的总体积。,假定凝胶与待分离的溶质之间不存在相互作用，那么凝胶过滤可以看成是一种液-液分配层析。凝胶珠内的水相是固定相（Vi），凝胶珠外的水相是流动相（V0），溶质在Vi和V0之间分配。能进入Vi的溶质的量决定于它的大小和凝胶孔的大小。溶质在
12、柱中的移动速度取决与它在两相之间的分配系数（Kd）：,Kd是溶质分子大小的函数，而与凝胶床的几何形状无关。对于完全被排阻在凝胶珠内外的大分子来说，它们将在同一洗脱峰出现，Ve=V0，Kd=0；对于完全能自由出入凝胶珠内外的小分子，Ve=V0+Vi，Kd=1；对于在分级范围内的中等分子，凝胶珠内部的有些微孔它们能扩散进去，有些则不能，因此一般情况下，Kd总是在0与1之间。,但有时发现Kd1，这表明凝胶对溶质有吸附作用。整理上式得：Ve=V0+Kd Vi 从这个式子可以看出，某一溶质的Kd就是该溶质能扩散进入珠内的空间部分占其总空间（Vi）的分数。,由于实际测定Vi有困难，所以上述的公式很少使用。
13、经修正，用凝胶珠内的总体积代替上式中的内体积（Vi）来表示Kd，此时Kd改用Kav，称可用分配系数（avaliable coeffient）：,只要测得Vt，V0和Ve，即可计算Kav值。对于两种不同分子量和不同Kav值（Kav和Kav）的组分,它们的洗脱体积之差：Vs=Ve-Ve=（Kav-Kav）（Vt-V0）因此,为了完全分开两种组分,样品的体积一定不能大于Vs。上面这个式子可以用来计算某一提纯过程的最适柱床体积。,处理介质装柱平衡上样洗涤洗脱介质再生,层析的一般步骤,(二)利用溶解度差别的分离方法,等电点沉淀和pH控制蛋白质处于pI时，净电荷为零。沉淀溶解度最低pHpI 蛋白质带电，溶
14、解度较大pHpI,1 不同蛋白质等电点不同 pI时溶解度最低将蛋白质彼此分开,2蛋白质的盐溶和盐析,中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度 盐溶作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层使蛋白质分子被此排斥，蛋白质与水分子的作用加强，溶解度提高。同样浓度（摩尔数/升）的两价离子的中性外，如MgCl2（NH4）2SO4对蛋白质溶解度的影响效果，要比单价离子的中性盐如NaCl,NH4Cl大得多。,盐析当离子强度增加到足够高时，eg.饱和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀出来，这种现象叫盐析。原理大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐
15、离子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析法分离、提纯常用方法。保持蛋白质的天然构象。（NH4）2SO4,3.有机溶剂分级法,作用原理：,.有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，。蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。.有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。,聚乙二醇（水溶性非离子聚合物）可致使蛋白质沉淀。原理：脱去蛋白质的水化层；聚乙二醇与蛋白质亲水基团发生相互作用，并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓度，pH，及绝对溶解度无关。其溶解
16、度依赖于聚乙二醇的分子量。,4温度对蛋白质溶解度的影响。,0-40摄氏度 大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增大40-50摄氏度 大部分蛋白质变得不稳定,开始变性大多数蛋白质在低温下比较稳定,蛋白质的操作在0摄氏度或更低温度下进行.,糜蛋白酶,胰蛋白酶及其前体的制备,(三)根据电荷不同的分离方法,根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。1电泳 在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳(elecctropHoresis)或离子泳(ionpHoresis)。,或从方法学的角度给电泳下定义，电泳
17、是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷不同分离分子混合物的一种实验技术。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋曰质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。,带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用：F(电场力)=qE(=qU/s)Ff(摩擦力)=fv,这里，q颗粒所带的电量E电场强度或电势梯度U/qU两电极间的电势差(以伏特表示)S=两电板之间距离(以厘米表示)f摩擦系数(与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关)v颗粒泳动速度(以厘米秒表示,当颗粒以恒稳速度移动时，则F-Ff=0，因此，qE=Fv，即，v/E=q/f 在
18、一定的介质中对其一种蛋白质禾说，q/F是一个定值，因而v/E月也是定值，它被称为迁移率或泳动度：u=v/E,u值可以通过实验测得，蛋白质的u值为0.1*10-4-1.0*10-4 厘米2伏特-1秒-1。蛋白质的泳动度以及pH和离子强度对泳动度的影响都反映某一特定蛋白质的特性。因此电泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯厦的重要手段而且也是研究蛋白质性质很有用的一种物理化学方法。,电泳基础：自由电泳（移动界面电泳）,a.先在u-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面b.加电场c.由于界面处存在浓度梯度，因而产生折射率梯度。利用光学系统可以观察到界面的移动。每个移动界面相当于一个特定蛋白质。
19、,区带电泳,是由于在支持物上电泳时各组分因迁移数度不同分布成区带而得名。按支持物介质的物理性状：四类区带电泳：1.滤纸电泳.薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳,薄膜电泳)2.粉末电泳:淀粉.纤维层.硅胶粉3.细丝电泳:尼龙丝,人造丝4.凝胶电泳:聚丙烯酰胺.琼脂糖凝胶,盘状电泳,在区带电泳基础上发展起来的。支 持 物聚丙烯酰胺凝胶,三种物理效应：1。样品的浓缩效应2。凝胶对分子的筛选效应3。电泳分离的电荷效应样品分离效果好、分辨率等。,等电聚焦（电聚焦）,蛋白质混合物的分离是在具有pH梯度的介质中进行的。用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液介质固体化、操作方便、分离快蛋白质聚焦在等于其等电点的pH点处，形成一个很
20、窄的区带。,双向电泳-AA混合物一次电泳不能完全分开,将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触吸印转移到第二个支持介质上,旋转90进行第二次电泳,称双向电泳.优点:设备简单.操作方便,样品用量少,1975年，OFarrell 首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的
21、蛋白图谱。,2 离子交换层析,原理：根据蛋白质等电点的差异将不同蛋白质分开。离子交换介质：(1)离子交换树脂(2)离子交换纤维素(3)Sepharose Fast Flow:(4)Sepharose High Performance：分辨率较F.F.高(5)Mono:HPLC,I 分类：阴离子交换 强度 功能基团+DEAE 中等 OCH2CH2NH(CH2CH3)2+QAE 强 OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3 阳离子交换 强度 功能基团 CM 弱 OCH2COO-SP 强 CH2CH2CH2SO3-II 选择：i 根据蛋白质的等电点选择介质 ii 根据分离目的选择介质,例如：
22、离子交换纤维素纤维素为交换基质原理：具有松散的亲水性网状结构，吸较大的表面积，大分子可以自由通过优点：交换容量大洗脱条件温和回收率高品种多，选择范围广,离子交换葡聚糖基质：交联葡聚糖优点：交换容量比离子交换纤维素大34倍。能根据净电荷分子大小分离,蛋白质混合物的分离由 溶液中的盐离子强度pH 来完成结合力小蛋白质先由层析柱中洗脱出来洗脱时保持洗脱剂成分不改变改变洗脱剂的盐浓度、PH值,跳跃式分段改变（分段洗脱）渐进式连续改变（梯度洗脱）梯度洗脱优点：分离效果好分辨率高适合：交换容量小，对盐敏感的离子交换剂,两种混合器:简单型混合器 复合型混合器,注意的问题：(1)缓冲液的选择：阳离子：Tris
23、 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐(2)介质处理：阳离子：Na+型 阴离子：Cl-型(3)洗脱：原理：i改变盐浓度 ii改变pH值方式：i分步洗脱 ii梯度洗脱(4)介质再生,（四）蛋白质的选择吸附分离,吸附层析-利用吸附力的强弱不同而达到分离的目的。吸附剂-结晶磷酸钙及羟基磷灰石蛋白质分子中带负电荷的基团，与羟基磷灰石的钙离子结合。用磷酸缓冲液羟基磷灰石-分离核酸：病毒。活性C 硅酸 AL2O3磷酸钙-吸附层析,（五）根据对配基的生物学特异性的分离方法-亲和层析,基础：基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合）配基：能被生物大分子所识别并于之结合的原子，原子团，和
24、分子：酶-底物;激素-受体；抗原：抗体。,原理,先把待提纯的某一蛋白质的特异配基，通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上，在配基与多糖基质间迁入一个连接臂使配基于凝胶之间保持足够的距离，不改变载体表面的空间位阻妨碍等待分离的大分子与其配基的结合。,待提纯的蛋白质样品+多糖材料待提纯的蛋白质样品与配体结合，吸附，在琼质糖颗粒上结合在柱上的蛋白其它蛋白可以用自由配体的分子溶液脱下来,1 原理：利用蛋白质特异性进行分离。2 介质准备：载体选择：Sepharose 4BSepharose CL4B,Sepharose Fast Flow,Sepharose High Per
25、formance 空间臂：偶联小分子时需要空间臂，常为双功能基团，如己二氨或氨基己酸。,3 配基选择：抗原抗体，酶抑制剂，酶底物，激素受体，金属结合蛋白螯和剂，含巯基蛋白Hg或含巯基分子，凝集素糖蛋白4 偶联：I 溴化氰法：与氨基或氨基偶联。效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。II 环氧氯丙烷法：与NH2,OH,SH 偶联 偶联时需强烈条件，如pH11，4050，适于特别稳定的蛋白,六蛋白质含量的测定与纯度的鉴定,分析工作：（一）测定蛋白质的总量；（二）测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量；（三）鉴定最后制品的纯度。（四）活性测定,（一）浓度/含量测定 1 紫外法：蛋白质的芳香族氨基
26、酸在280nm 有吸收。2 Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。3 Bradford法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。4 凯氏定氮法 5 双缩脲法,（二）测定蛋白质混合物中某一特定蛋白质的含量,-具有高度特异性的生物学方法酶活性激素活性抗原-抗体,（三）蛋白质制品纯度的鉴定,1 电泳法：SDSPAGE，IEF 2 化学法：N端测定，C端测定 3 仪器法：HPLC，质谱，氨基酸组成分析 4 物理方法：沉降分析 扩散分析,（四）活性测定,1 激酶：标记ATP 2 磷酸化酶：定磷 3 利用靶酶活性 4 氧化还原酶 5 ELISA,溶菌
27、酶：分子量为14KD，等电点为11，耐热，能够水解革兰氏阳性细菌的细胞壁，鸡蛋清中含量丰富。,举例：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶,纯化步骤：150克鸡蛋壳，1 NaCl0.05 N HCl,40抽提20醋酸调pH4.6，75处理3分钟，离心取上清加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量50的CaCl2，离心取上清在上清中加NaCl至终浓度5，将样品加到Sephadex G-50层析柱中(5X25cm)，0.6%NaCl洗脱，流速40毫升/小时，收集洗脱液5ml/管测活，合并含溶菌酶部分聚乙二醇浓缩结晶,蛋白质的分离纯化小结,1 材料获得：天然获得新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。；基因工程手段获得对于天然不易得到的蛋白，通过工程菌或工程细胞表达而获得。2 粗分离：除去大量杂质和杂蛋白，初步浓缩目的蛋白。,3 细分离：常压柱层析（1）分子筛层析（2）离子交换层析（3）疏水层析（4）亲和层析,4 电泳：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电聚焦电泳，双向电泳。5 蛋白质鉴定（1）蛋白质纯度鉴定（2）蛋白质浓度测定（3）蛋白质活性测定,
