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1、第3章 蛋白质的通性、纯化和表征,蛋白质的性质蛋白质的分离纯化,蛋白质的性质,蛋白质的两性解离（酸碱性质）蛋白质的胶体性质蛋白质的变性和复性蛋白质的紫外吸收蛋白质的呈色反应蛋白质的沉淀,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的和-羧基、赖氨酸残基中的-氨基、精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的咪唑基，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为0，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则相反。,蛋白质的
2、两性解离,体内大多数蛋白质的等电点接近pH5.0，在体液pH7.4环境下可解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等，也有少量蛋白质为酸性蛋白质，如胃蛋白和丝蛋白等。蛋白质的电泳和离子交换层析技术就是依据蛋白质的两性解离性质。蛋白质在pH值低于或高于其pI时带有电荷，在电场的作用下移动，称为电泳。由于各种分子所带电荷的多少及分子量大小不同，因而它们在电场中移动速度也不同，可用于检测、分离蛋白质。根据支持物的不同，电泳可分为薄膜电泳、凝胶电泳等，如凝胶电泳的支持物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶.,酸性蛋白质的等电点为酸性，碱性蛋白质的等电点为碱性。,等电点时蛋白质的特性：溶解度最
3、小，应用于蛋白质的分离、提纯粘度最小渗透压最小膨胀性最小导电性最小,蛋白质的胶体性质,蛋白质是高分子化合物，分子直径大小为1-100 nm,属于胶粒的范围。维持蛋白质胶体溶液稳定的重要因素有两个，一是蛋白质胶体颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，形成颗粒表面水化膜；另一是蛋白质胶粒表面带有同种电荷。二者可起胶粒稳定的作用，从而阻断蛋白颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。如除去蛋白胶粒上述两个稳定因素时，可使蛋白质从溶液中析出。在蛋白质分离中的盐吸和丙酮沉淀就是依据这一原理。另外,蛋白是生物大分子，依据不同蛋白质分子大小差异,在通过有分子筛作用的凝胶时受到排除力不同，可利用透析、凝胶过
4、滤、分子筛层析、超离心等技术分离蛋白质。,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、电泳现象、不能通过半透膜等。蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层，非等电点时带电荷；应用：利用透析法或超过滤法可纯化蛋白质：将非蛋白质的小分子物质除去，破坏蛋白质胶体的稳定的因素，可以将蛋白质分离,蛋白质的变性和复性,蛋白质在某些理化因素的作用下空间构象受到破坏,从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性(denaturation)。变性的实质是蛋白质的天然构象受到破坏,涉及二、三、四级结构的改变,二硫键及各种次级键破坏，但一级结构不变，无肽键断裂.变性后
5、由于肽键松散，面向内部的疏水基团暴露于分子表面，蛋白质分子溶解度降低并互相聚集而易于沉淀，其活性随之丧失。另外表现为粘度增加,结晶能力消失，易被蛋白酶水解.造成蛋白质变性的因素有多种，常见的有高温、高压、紫外线和乙醇等有机溶剂、重金属离子及生物碱等。在医学上，上述变性因素可导致病源微生物蛋白的变性失活，常被用来消毒灭菌。相反，在蛋白质分离纯化过程中或有效保存蛋白质时，应防止蛋白质变性。,当蛋白质变性程度较轻，可在消除变性因素条件下使蛋白质恢复或部分恢复其原有的构象和功能,称为复性(renaturation)。但许多蛋白质或结构复杂或变性后空间构象严重破坏，不可能发生复性，称为不可逆变性。,蛋白
6、质的紫外吸收,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。,蛋白质的呈色反应,蛋白质分子中肽键可与某些试剂发生显色反应，且产生的有色物质与蛋白质浓度相关，氨基酸则不出现此反应。此特性可用于蛋白质定性、定量检测，如双缩脲反应。,蛋白质的颜色反应：双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。,蛋白质分子大小与形状,蛋白质分子的大小：11041106D蛋白质分子的形状：球形，纤维状、椭圆形,蛋白质分子量的测定,根
7、据化学组成测分子量 凝胶过滤层析（分子筛层析）SDSPAGE法超离心法渗透压法,根据化学组成测分子量,对含微量元素的蛋白质，先测定微量元素的含量，然后确定最小分子量，如肌红蛋白含铁为0.335，其最低相对分子量为;最低相对分子量=铁的原子量100/铁的百分含量 55.8100/0.335=16700测定蛋白质中氨基酸含量少的氨基酸,凝胶过滤（分子筛层析法）,原理：蛋白质分子通过层析柱的速度并不直接取决于分子质量，而是它的斯托克半径，如果蛋白质与一种理想化的非水化的球状物有相同的过柱速度，则认为两者有相同的斯托克半径。如果用标准蛋白和待测蛋白有相同的分子形状，那么用这种方法就可以测定蛋白质的分子
8、量数值。logMr=a-bVe实验只要测得几种标准蛋白质的洗脱体积，以它们的分子质量的对数对Ve作图得一直线，再测得样品的Ve，即可从图中确定蛋白质的相对分子质量优点：待测样品可以不纯。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,原理：蛋白质所带电荷和大小不同，在电场中的泳动速度各异。电泳系统中加入SDS和少量巯基乙醇，则蛋白质的泳动速度主要取决于分子量而与蛋白质本身的电荷无关。加入SDS和少量巯基乙醇破坏了蛋白质的原有的高级结构，有四级结构的蛋白质也都解离为亚基，且蛋白质都变为椭圆状，并带上大量的负电荷，电荷的多少只与蛋白质多肽链的分子大小成正比。,蛋白质的电泳迁移率与其分子量的对数呈线性关系。电泳迁移
9、率=蛋白质移动距离/示踪小分子移动距离。用已知分子量的蛋白质制得标准曲线，在同样条件下测出未知蛋白质的迁移率即可从标准曲线上求得近似分子量。对有四级结构的蛋白质，该法测的是蛋白质亚基的分子量。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量 测定蛋白 标准蛋白,R,超离心法,其包括：沉降速度法和沉降平衡法沉降速度法：在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心力（离心力减去浮力）与溶剂的摩擦阻力平衡时，单位离心场的沉降速度为定值，称为沉降系数或沉降常数。S=dx/dt/2 x,蛋白质的沉降系数介于110-13到200 10-13秒的范围，1 10-13秒为一
10、个S,因此沉降系数8 10-13表示为8S.蛋白质的沉降系数与分子量没有正比关系，因还受蛋白质分子摩擦系数（即分子形状）的影响。当同时测得扩散系数，则可利用斯维得贝格公式计算分子量。M=RTs/D(1-V)D 为扩散系数V为偏微比容，蛋白质为0.74厘米3/克为溶剂的密度。该法还可用于鉴定蛋白质的均一性。,超速离心机,6000080000转/分重力60万80万倍,蔗糖密度梯度,蔗糖浓度,蛋白质的沉淀作用,蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象。,蛋白质的沉淀作用,等电点沉淀法中性盐析沉淀反应有机溶剂沉淀反应加热沉淀反应重金属盐沉淀反应生物碱试剂沉淀反应,1.中性盐析沉淀反应,盐析
11、作用：高盐时，因破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这种现象称盐析作用。机理：破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，因而促使蛋白质颗粒相互凝聚而沉淀。盐溶作用：低浓度的盐可以使蛋白质溶解度增加，称为盐溶作用。原因：低盐可以使蛋白质表面吸附某种离子，导致同性电荷增加而排斥增加，同时与水分子的作用也增强。,盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。,盐溶作用是由于在盐浓度较低时，盐离子被蛋白质分子吸附，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作
12、用却加强了，因而溶解度增加。,不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%饱和度,饱和,析出,析出,分 段 盐 析,2.有机溶剂沉淀反应,在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。,3.加热沉淀
13、反应,加热可以使蛋白质变性，常常可导致蛋白质的沉淀，一般在等电点时最易沉淀。应用：分离蛋白质时除去杂蛋白。,4.重金属盐沉淀反应,蛋白质在pH大于等电点时带负电荷，可以与重金属离子结合，形成不溶性蛋白质沉淀。应用：抢救重金属中毒的患者,5.生物碱试剂沉淀反应,生物碱试剂是一些酸，如苦味酸等蛋白质在pH小于其等电点时带正电荷，可以与生物碱试剂结合，形成不溶性蛋白质沉淀。应用：血液样品分析中无蛋白滤液的制备,变性和沉淀的关系,两者既有联系，又有区别：变性蛋白质通常都是沉淀，但也有的不沉淀。沉淀的蛋白质：有的变性，有的不变性。,蛋白质的分离纯化,一、分离纯化的一般原则二、分离纯化的方法三、蛋白质分子
14、量的测定,研究其结构与功能工农业生产的需要医疗业的需要研究需要,一、分离纯化的一般原则:增加制品纯度或比活,(1)破碎：目的：把蛋白质从原来的细胞和组织中以溶解状态释放出来，并保持活性。动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器植物组织和细胞：研磨或纤维素酶处理细菌：超声波震荡、与沙研磨、高压挤压或溶菌酶处理如蛋白质在细胞的某个组分：差速离心，如细胞核,前处理：提取,(2)抽提：目的是使蛋白质溶解根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)分离：目的是除去其它蛋白质等物，缩小体积。离心除去固体杂质后，可通过沉淀法
15、、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)纯化：目的是使蛋白质进一步纯化 可用层析法、电泳法等进行精制。(5)成品加工：真空冷冻干燥成成品。,大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50 mmol/L的磷酸盐缓冲液（）或0.1 mol/L Tris-HCl（）缓冲液作提取液。,(NH4)2SO4分级沉淀法（盐析）等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法（有机溶剂冷却、搅拌）使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。,一般蛋白质样品经粗制
16、分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率柱层析及电泳方法。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。,根据蛋白质溶解度不同的分离方法,1、蛋白质的盐析,2、等电点沉淀法,3、低温有机溶剂沉淀法,二、分离纯化的一般方法,根据蛋白质分子大小的差别的分离方法,1、透析：利用蛋白质分子不能透过半透 膜，使蛋白质和其他小分子分开。超滤：蛋白质的浓缩,2、凝胶过滤：利用蛋白质分子大小不同将蛋白分开。,3、密度梯度离心：每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时停止，从而在离心管中分离成独立的条带,透析袋,酶溶液,蒸馏水,加压,酶溶液,超
17、滤膜,支持栅板,超滤液,图3-1 透析装置,图3-2 超滤装置,凝胶作为支持剂凝胶颗粒内部具有多孔网状结构。被分离的混合物流过层析柱时:,凝胶过滤柱层析（分子筛层析）,大分子先下来小分子后下来,分子筛层析原理示意图,分子筛层析与洗脱曲线,凝胶颗粒,收集蛋白质管,蛋白质混合物,大分子,从柱上面加缓冲溶液,小分子,洗脱体积（Ve）,凝胶柱,大分子,小分子,Ve1,Ve2,V0,蛋白质Mr=49,000,洗出液中的蛋白质浓度,洗脱体积（mL）,未知,logMr,洗脱体积与相对分子质量的关系,Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo),凝胶的种类和性质 交联葡聚糖凝胶（Sephad
18、ex)Sephadex G 系列 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。琼脂糖凝胶（Sepharose；Bio-Gel)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越 大，网状结构越密集。聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双 丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品 名为生物胶P（Bio-Gel P)。聚丙乙烯凝胶（Styrogel)大网孔结构。,根据蛋白质带电性质进行分离,1、电泳法,2、离子交换层析法,SDS-PAGE separates proteins by MW,SDS（十二烷基硫酸钠）:一种阴离子去污剂，作为变性剂
19、破坏分子内的疏水作用和氢键。目前测定亚基分子量的最好办法。,SDS,均勻带上一层负电荷所有的SDS-蛋白质复合体有相同的荷质比亚基构象改变，SDS-蛋白质复合体为棒状由于不同的SDS-蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于分子量。,原态蛋白质,肽链伸展SDS 以其烃链与蛋白质分子的侧链结合，每克蛋白可结合1.4克SDS，相当于每两个氨基酸残基结合一个SDS,棒状,离子交换层析ion exchange chromatography,离子交换层析分离蛋白质示意图,低盐洗脱液,高盐洗脱液,混合蛋白质,常用的阳离子交换剂,离子交换剂 可电离基团 可
20、电离基团结构,CM-纤维素（弱酸型）羧甲基,P-纤维素（中强弱酸型）磷酸基,SE-纤维素（强弱酸型）磺乙基,SP-纤维素（强弱酸型）磺丙基,常用的阴离子交换剂,AE-纤维素（弱减型）氨基乙基,离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构,PAB-纤维素（弱减型）对氨基苯甲酸,DEAE-纤维素 二乙基氨基乙基,DEAE-Sephadex 二乙基氨基乙基,DEAE-纤维素（强减型）二乙基氨基乙基,QAE-纤维素（强减型）,二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基,（中弱减型）,（中弱减型）,等电聚焦（isoelectric focusing）,原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyt
21、e,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量,pH10,pH3,pI1=pH8,pI2=pH7,pI3=pH5,-,+,线性梯度,双向电泳,利用配体的特异性亲和力的纯化方法,亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来
22、，并且纯度相当高。亲和层析最先用于酶的纯化并从中得到发展，但现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整的细胞的纯化。,亲和层析（affiuity chromatography）,应用 分离纯化酶、抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能,a.理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性,原理：,基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex,亲和层析原理示意图,蛋白质混合物,配体,与配体结合的蛋白质,加入的可溶性配基,专一性结合蛋白质,没有结合的蛋白质,基质,分离纯化蛋白质所依据的蛋白质性质,大小：电泳、离心、凝胶过滤、超滤、透析形状：电泳、凝胶过滤电荷
23、：电泳、离子交换层析等电点：等电聚焦电泳、等电点沉淀疏水性（疏水补丁）：疏水相互作用层析、反相色谱溶解度：盐析、等电点沉淀、变性沉淀、有机溶剂密度：3）密度梯度离心配体结合能力：亲和层析金属结合能力：金属螯合层析（酶的纯化）可逆性缔合：微管蛋白的纯化（温度依赖）翻译后修饰：凝集素亲和层析分离受体蛋白寻常性质：碱性磷酸酯酶、CaM的分离纯化（耐热）基因工程构建的纯化标记：His-Ni的结合,超声破碎仪,超滤装置,柱层析实验装置,自动部份收集器,FPLC,蛋白质的定量法,凯氏(Kjeldahl)定氮法:浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3双缩脲(biuret)法:CuSO4与肽链的氨基结合Folin-Phenol法:紫外法:280纳米处的紫外吸收(1 OD280=1 mg/ml)Bradford法:考马斯亮兰(Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化双金鸡宁酸(bicinchoninic acid)法:FDA唯一认可,蛋白质的纯度鉴定,蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。OD280/OD2601.75,
