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1、过氧化物酶同工酶的提取、分离,实 验 四,学时：9,1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法；2、掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原理及方法。3、了解过氧化物酶(POD)的生物学功能。,一、实验目的：,1、过氧化物酶：过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传
2、育种中的重要作用也正在受到重视。,二、实验原理:,2、同工酶概念：同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如POD在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。,二、实验原理:,(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。(2)影响电泳效果的因素：带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之
3、越快；,3、电泳：,溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。,续(2)影响电泳效果的因素：,聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。,4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：化学法 光聚合法,(1
4、)聚丙烯胺凝胶的生成：,化学聚合：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N、N四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；光聚合：催化剂是核黄素（VB2），在痕量氧存在下，核黄素光解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。,聚合反应：,架桥物造成分枝,端点自由基 可再延续,freeradical,Bis,Bis,聚合反应,交错连结,自由基形成,聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起
5、；链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质；网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。,(2)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：,（1）凝胶度：是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂（Bis）的总克数，用T%表示。（2）交联度：是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的 百分数，用C%表示。一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。,(3)凝胶的质量决定因素：,聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T(总百分浓度)和C(交联百分浓度
6、)。,上式中：a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液体积（ml）。当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4时，有效孔径最小，C大于或小于4时，有效孔径均变大，C大于5时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6和3。a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。常用29：1,第一、三个不连续性：凝胶孔径的不连续；缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续；在电场中形成的电位梯度的不连续。第二、不连续系统中的三种物理效应：电荷效应：分子筛效应:浓缩效应:,(4)不连续PAGE的原理：,不连续PAGE电泳胶体系统的组成：,1
7、,电泳系统,pH,胶体浓度,缓冲液,上层(负极)缓冲液,2,样本溶液,3,浓缩胶,6.7,4,分离胶,胶体,5,下层(正极)缓冲液,在浓缩胶中的三个主要作用角色：,甘氨酸:pH=8.9 负电荷,pI=6.7 不带电荷,Cl-1:,蛋白质(酶):,浓缩效应：,分离胶,浓缩胶,样本,8.9,6.7,离子缺乏空间,A,B,C,+,+,8.0,以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：,该红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。,5、过氧化物酶活性测定,三、实验材料、主要仪器和试剂,
8、1材料：小麦幼苗 2仪器：（1）分光光度计；（2）移液管（3）离心机（4 000r/min）；（4）研钵(5)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；(6)稳流稳压电泳仪；（7）高速冷冻离心机；（8）电子天平；（9）电冰箱；（10）瓷盘、微量进样器；（11）电热恒温水浴锅；（12）S-22pC可见分光光度计；（13）电炉等,3、试剂：（1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制；（2）分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HCl缓冲液）：（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：（4）分离胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液）：（5）浓缩胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液
9、）：（6）过硫酸铵溶液（NH4）2S2O8简写Ap：（当天配制）；（7）核黄素溶液：8%（8）电极缓冲液：（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）（9）40%蔗糖：（10）pH4.7乙酸缓冲液：,（11）样品提取液：（12）0.5%的溴酚蓝：0.5g溶于100ml无离子水；（13）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：1g联苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36ml水用时加160ml水加Vc140.8mg加几滴30%过氧化氢原液。联苯胺是致癌物质，称取时应戴手套；（14）0.05M pH5.5磷酸缓冲溶液；（15）0.05M 愈创木酚；（16）2%H2O2；,1、贮液的配制：2、凝胶的制备：2.1 胶板的制备：
10、2.2 分离胶的制备：2.3 浓缩胶的制备：3、酶液的制备：4、装槽、点样：5、电泳：6、剥胶、固定、染色：,四、实验步骤：,2.1 胶板的制备：,2.2 分离胶的制备：按下表制备分离胶,胶灌至距梳子齿下端1cm 灌毕封上一层水加速聚合当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。,2.3 浓缩胶的制备：按下表制备浓缩胶,用滤纸吸干水倒入浓缩胶插入梳子封水，照光当胶色由黄变为乳白色表明聚合好。,3、酶液的制备：称取大麦幼苗茎部1g 加样品提取液1ml 于冰浴中研成匀浆然后以2ml提取液分几次洗入离心管在高速离心机上以4000转/每分钟，离心10min 倒出上清液，以等量40%蔗糖混合低温放置待用。,4.1 装槽：取出胶板下端胶条用滤纸擦净凡士林油将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）上下槽装电极缓冲液。,4.2 点样：轻拔电泳梳子用微量进样器点样每孔约30l。,5、电泳：接通电源稳流调节电流到每孔1mA左右当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可适当加大电流待前沿下行到距胶末1cm处，停止电泳。,6、剥胶、固定、染色：将凝胶板取下放入装水瓷盘中剥下胶片并浸洗二次倒去水加入固定液10分钟倒去固定液加显色液（联苯胺），显色观察记录。,绘制酶谱，计算出迁移率；,五、结果与计算：,六、思考题：,1、影响电泳的主要因素有哪些？2、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个 不连续，及三种物理效应。,
