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1、第三章 酶的分离纯化与保存,酶的分离纯化是酶学研究的重要环节之一。针对化学本质是蛋白质的酶而言，其分离纯化的方法主要沿用蛋白质分离提纯的方法。酶的分离纯化又有其自身特点：难点：目标酶在细胞中含量少优势：可通过测定酶活性的方法进行示踪酶的分离纯化是一门实验科学,酶的分离纯化，就是将酶从细胞或者其他含酶的原料中释放出来，再与杂质分开，而获得符合研究和使用要求的酶制品的过程,细胞结构与酶分布,胞内酶：在细胞中，酶在核糖体上合成后，即转运到各个作用部位，并不断补充和更新胞外酶：合成后穿过质膜，定域到质膜外表面、周质空间、外膜及细胞外环境中的酶不同的酶分离纯化的方法不同：胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分
2、离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化,选用技术前，需考虑：,1.目标酶分子特性及其他物理、化学性质2.酶分子和杂质的主要性质差异3.酶的使用目的和要求4.技术实施的难易程度5.分离成本的高低6.是否造成环境污染,不同酶的分离、提纯方法，主要根据：,酶分子之间各种选择性的差异 分子大小和形状酸碱性质溶解度吸收性质对其他分子的生物学亲和力 等等,酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,酶的分离纯化可以分为三个阶段,1、粗蛋白：多使用盐
3、析沉淀法，可以粗略去除蛋白质以外的物质；2、部分纯化：使用各种层析法；3、均质酶：目标酶的进一步精制纯化，常用电泳或者色谱法。,主要过程：细胞破碎 酶的提取 离心分离 过滤 沉淀 层析 电泳 萃取浓缩干燥 结晶 保存。,一、酶分子制备的前处理,1、生物材料的选择选择目的酶含量高的选择容易取材的利用细胞培养技术和基因工程重组DNA技术。目前，酶的来源大都为来自微生物,材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻保存，且动物材料则需深度冷冻保存：,动物组织要先除去结缔组织、脂肪等，绞碎后在适当的溶剂中提取。如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及
4、时将菌体与发酵液分开。,2、细胞的破碎,将细胞和组织破碎，使酶分子（胞内酶）充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法,物理破碎,温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween,酶促破碎（酶解破碎）,自溶法外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外
5、层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,机械法（注意预冷）：,捣碎法：10000rpm研磨法：匀浆法：研杆和管壁间只有几百微米,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,物理法：,反复冻融法：时间长，需加蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA等）超声波处理法：处理时间尽量短，避免局部过热使得酶失活 渗透压法：冷热交替法：,JY92-II D超声波细胞粉碎机,高压细胞破碎机,化学与生物化学方法,自溶法：利用细胞自身酶系，保持一定pH和温度条件，使细胞破坏有机溶剂处理法：通过有
6、机溶剂对细胞膜的作用，使得细胞破碎（Tween,Triton，氯仿等）酶解法：根据细胞外层结构特点，加适当的酶破坏细胞壁，并在低渗溶液中使细胞破碎如：霉菌：几丁质酶,酵母细胞：葡聚糖酶,3.生物大分子的提取（抽提）,“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。酶的定位不同，其提纯难度也不相同“固相转入液相”，或“从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中”。相似相溶,酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中（水、稀酸、稀碱、稀盐溶液等），非极性物质
7、易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中,提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。,为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。,盐溶液提取：,一般以低盐溶液(0.05-0.2mol/L)为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。盐溶：在低盐浓度条件下，酶的溶解度随盐浓度增大而增大盐析：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度随着盐浓度增大而降低,大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度
8、随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。,(2)稀酸（碱）溶液提取,在偏离等电点0.5左右，溶解度增大根据等电点，选择合适的pH注意，不能采用极端pH值，操作时要注意避免局部过酸或过碱,(3)变性剂的使用,如：脲、胍等膜（蛋白）酶，包涵体形式的酶等有变性剂，蛋白结构松散，易于溶解去除变性剂，又可恢复原来构象,典型的抽提液组成,离子强度调节剂：蔗糖、KCl、NaCl等pH缓冲剂：各种缓冲液温度效应剂：DMSO、甘油蛋白酶抑制剂：PMSF、亮肽素抗氧化剂:DTT,巯基乙醇重金属络合剂：EDTA增溶剂：Triton-100,（4）有机溶剂提取,一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶。
9、常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。,酶的主要提取方法,二、酶分离纯化的基本技术（简介）,溶解度：盐析、沉淀分子大小：离心、凝胶层析、过滤电荷：离子交换层析、电泳亲和性：亲和层析萃取结晶等等,(一)沉淀 根据不同物质在溶剂中的 溶解度不同而分离,沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,酶分子
10、制备中最常用的几种沉淀方法,中性盐沉淀（盐析法）：有机溶剂沉淀：选择性沉淀 等电点沉淀：有机聚合物沉淀：聚乙二醇,中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。对许多生物活性物质具有稳定作用。,1、中性盐沉淀,在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。,中性盐的选择,常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中最重要的是（NH4）2SO4：溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的
11、溶解度（酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，盐析操作也要求在低温下（04）进行）,分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75的杂蛋白，纯度提高了四倍。不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用23mol/L的(NH4)2SO4保存可达数年之久。可以分级沉淀:半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。价格便宜，废液不污染环境。,影响盐析的因素盐饱和度的影响 不同的蛋白质，所需的饱和度不同蛋白质浓度的影响 在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也愈强，分辨率降低，一般常将蛋白质浓度控制在23 为宜,
12、pH的影响但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液的pH值在4.55.5之间，使用时多用浓氨水调整到pH7左右。进行盐析时的pH，要选择在被盐析的蛋白质的pI附近温度的影响 在高盐浓度下，它们的溶解度随温度的升高反而降低。另外，高温还易导致蛋白质变性。蛋白质的盐析一般在室温下进行。,注意事项：,添加固体时，要加粉末状的盐并且缓慢分批添加并缓缓搅拌，避免局部浓度过高且注意不要产生泡沫,2、有机溶剂沉淀,有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。,有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介
13、电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。,常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等,基本原理,有机溶剂沉淀主要是降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用溶液介电常数的减少就意味
14、着溶质分子异性电荷库仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。,优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质 只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。,3、选择性变性沉淀法,利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。方法：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如Ag+、Cu2、Pb2 等、加有机酸如三氯乙
15、酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。,4、等电点沉淀法,等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物,氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。,5、有机聚合物沉淀法,有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一
16、些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。应用最多的是聚乙二醇(PEG)，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为600020000的 PEG。作用机制不明。,优点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。,（二）透析,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。袋内：大分子量的生物大分子袋外：盐和小分子物质不断扩散透析到，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。,（三）过滤,过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同),四种常用膜分
17、离过程的截留特性,超滤,超过滤即超滤，超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。,优点：操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。,缺点：不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到1050的浓度。超滤技术的关键是膜。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。,（四）电泳,电泳是指在电场的作用下，这些带电颗粒向着
18、与其所带电荷性质相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE),聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）,SDS(十
19、二烷基磺酸钠)-阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，使蛋白质舒展。并且每2个氨基酸与一个SDS结合，使得每个蛋白质分子所带电荷基本相同。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异，电泳迁移率只与蛋白质分子量大小有关,制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc-PAGE 进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。,有几个方法可以鉴定蛋白质的位置：(1)Coomassie Blue 染色法;(2)活性染色;(3)UV 照射呈像。定位后要把含有目标酶的凝胶切出來，进行电泳分离，获
20、得酶,（五）离心,离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。,密度梯度区带离心法（简称区带离心法）,差速离心法,（六）层析,层析法又称色谱法（Chromatography），是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,层析分离方法,离子交换层析,凝胶渗透层析,亲和层析,-
21、利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术,酶与底物酶与竞争性抑制剂酶与辅助因子抗原与抗体酶RNA与互补的RNA分子或片段RNA与互补的DNA分子或片段,（七）浓缩、干燥和结晶,浓缩：低浓度 高浓度离心、沉淀、吸水剂（PEG、硅胶等）蒸发浓缩：通过加热或者减压方法，使得溶液中部分溶剂汽化蒸发，常采用真空浓缩。,酶高温失活，一般在60以下，真空条件下进行浓缩或干燥真空干燥，另外还有冷冻干燥、喷雾干燥、吸附干燥、气流干燥等。,冷冻干燥,将酶液降温到冰点以下，使之冻结成固态，然后在低温状态抽真空，使冰升华，得到干燥的酶制剂酶质量高，结构完整，活力损失少，但是成本高
22、，适合对热敏感而价值较高的酶类,结晶,结晶与沉淀的区别沉淀和结晶在本质上同属一种过程，都是新相析出的过程。两者的区别在于构成单位（原子、离子或分子）的排列方式不同在条件变化缓慢时，溶质分子具有足够时间进行排列，有利于结晶形成；相反，当条件变化剧烈，强迫快速析出，溶质分子来不及排列就析出，结果形成无定形沉淀。由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶法具有高度的选择性。,酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。不同的酶对结晶时的纯度要求不同。有些酶在纯度达到50%时就可能结
23、晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。常用方法：盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶等。,三、分离纯化方法的选择及基本步骤,生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。由本章前述的生物大分子制备的各种特点可以看出，分离纯化方案必然是千变万化的,四、分离提纯操作要求,尽量减少酶活性的损失低温 05、有机溶剂：-15-20抽提液加入EDTA（络合金属）抽提液加入巯基乙醇（防止含-SH酶失活）不能过度搅拌
24、，以免产生大量泡沫，使酶变性pH值和盐浓度的控制抗菌、抑菌测定酶的比活力,早期分离纯化,特点：粗提取液中物质成份十分复杂。欲制备的生物大分子浓度很稀。物理化学性质相近的物质很多。希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。对所选方法的要求：要快速、粗放。能较大地缩小体积。分辨力不必太高。负荷能力要大。可选用的方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸附）；亲和层析等。,晚期分离纯化,可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。,注意的问题：,盐析后要及时脱盐。用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析
25、柱的上样体积只能是柱床体积的1/101/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法，例如分级有机溶剂沉淀，分级盐析，连续两次凝胶过滤或离子交换层析等。,分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。例如吸附不可以放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析的上样量可以不受限制，只要不超过柱交换容量即可。分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低温下（如在冷室中）进行。得到最终产品后，必要时要立即冰冻干燥，分装并写明标签，20 或7
26、0保存,五、酶的活力测定与纯度测定,1.酶的活力测定与比活性 评价提纯方法好坏的指标总活力的回收率反映提纯过程中酶活力的损失情况比活力提高的倍数反映纯化的效率在酶纯化的每个阶段，都需要进行上述测定两者合理安排，但通常不可兼顾，根据具体情况取舍。,2.纯度鉴定：,方法很多，检验是否还有继续纯化的必要由于酶分子高度复杂，不同方法检验出的结果可能不同酶纯度要注明：电泳纯、层析纯、HPLC纯。,鉴定依据：,酶分子的大小、形状：超速离心法、凝胶层析等酶分子的电荷性质：离子交换层析、电泳等酶分子的化学性质：一级结构测序（N端或C端）酶分子的溶解度：Northrop分析法酶分子的抗原性：免疫双扩散、单抗法,
27、Northrop分析法,在一定体积溶剂中，一种蛋白质在溶液中溶解的量曲线（X-总蛋白，Y-溶解的蛋白），有一个折点，斜率先为1，后为零，而如果有几种蛋白，则不同,总蛋白量,上清中的蛋白量,0,用提纯的酶免疫动物，可获多抗，如果酶不均一，可出现不只一条沉淀线,免疫沉淀法,六、酶的保存,主要任务：维持酶的天然构象 保证酶的催化活性,（一）影响酶稳定性的因素,温度：pH值和缓冲液氧酶蛋白的浓度和纯度,温度：,一般情况：低温条件（0-4）保持活性很多酶可以冷冻（-20）保存有些酶冷冻保存失活，如鸡肝线粒体的丙酮酸脱羧酶，兔肌糖原磷酸化酶可能原因：低温使得亚基间疏水键减弱，相间变化时的机械破坏，溶质冰晶
28、化与蛋白质结合水间相互关系的改变，等等,pH值与缓冲液,缓冲液：在某个区域有缓冲作用，因酶而异不同缓冲体系的影响磷酸盐缓冲体系：盐的溶解度对温度有依赖性，低温会造成局部pH的变化，使酶失活Tris-Cl体系：温度系数大，但是缓冲范围窄，pH7.5以下缓冲能力弱，对某些酶有抑制作用,氧：,部分酶在空气中不稳定，易缓慢失活巯基保护剂：防止巯基被氧化嫌气处理：充氮或者充氩保存，等等,酶蛋白浓度和纯度,稳定性：低浓度高浓度结晶或干粉低浓度酶液很容易失活，与亚基解离，容器壁吸附和表面变性等有关许多酶的粗制品比精制品更稳定碱性磷酸酶：粗品冻干粉20保存2年以上精品冻干粉 半年左右,（二）酶的各种稳定剂,底物、抑制剂和辅酶顺乌头酸酶：加柠檬酸D氨基酸氧化酶加：安息香酸钠（竞争性抑制剂）加：辅酶FAD酶分子处于局部扭曲状态，结合上述物质，降低能级，趋于稳定,-SH基保护剂：半胱氨酸（Cys），谷胱甘肽(GSH),-巯基乙醇（ME)，二硫苏糖醇（DTT）等巯基参与结合、催化底物，组成别构部位，维持高级结构，维持活性,其他：无机离子、金属盐、有机溶剂、甘油、蔗糖、表面活性剂等等如：钙离子可以保护-淀粉酶 20丙酮（乙醇）保护苯甲醇脱氢酶,
