高效液相色谱使用与维护.ppt

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1、高效液相色谱的使用与维护,浙江省疾病预防控制中心蔡增轩,液相色谱仪器部件日常维护色谱图相关术语实验操作与应用,一些商品化仪器,agilent,oe,HPLC的环境设置：,良好的接地专门房间定制台面不间断电源HPLC的日常操作条件：温度：1030,最好是恒温；空调器 相对湿度80,最好是恒湿;除湿机远离高电磁干扰、高振动设备;有良好的通风设施;通风罩,高效液相色谱仪组成,输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统,液相色谱流程图,HPLC,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,液相色谱的流动相,1.流动相特性（1）流动相（淋洗液，洗脱剂）：组成改变，极性改变，可显

2、著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱,常用溶剂己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。,3.流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。正相液-液分配分离：先选中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性

3、溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),高效液相色谱流动相溶剂的物化性质（部分）,合适选择性溶剂,液相色谱溶剂选择范围,液相色谱流动相溶剂的选择步骤：选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等 选择合适洗脱强度的溶剂：简单样品，2 k 5；复杂样品，0.5 k 20 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的值,所有溶剂,合适物理性质溶剂,合适保留值溶剂,液相色谱中的溶剂强度,1.溶剂强度是描述色谱性能的主要指标，

4、表示溶剂对样品的洗脱能力，它决定于溶剂与溶质之间分子的作用力。目前还没有一个统一标准描述不同类型液相色谱体系中的溶剂强度，而是采用相对极性和溶解度参数等作为溶剂强度指标。,1)溶解度参数（参见溶剂选择性）2)极性参数P 根据固定相和流动相的极性大小,人们把液相色谱分成：正相色谱：固定相极性大于流动相(包括硅胶吸附色谱)反相色谱：固定相极性小于流动相,正相色谱：增加溶剂极性，保留时间增大或变小？,反相色谱：增加溶剂极性，保留时间又如何变化？,洗脱强度与溶剂极性,分子之间相互作用有色散力、偶极作用、氢键和介电作用。某一溶质与其它分子相互作用大小的程度可以用极性大小表示。极性越大,它与其它分子的作用

5、力越大。“极性”溶剂容易吸收和溶解“极性”物质。,溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力,它不仅与流动相，而且与固定相的极性有关。在正相色谱中,“溶剂洗脱强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大,洗脱能力越小。,溶剂强度图,混合溶剂的极性,在液相色谱中,一般溶剂的极性变化二个单位,溶质的分配比差不多能有十倍的变化。通过溶剂强度参数的计算,可以较好地较快地选择合适溶剂或调整流动相的极性范围。如：正相色谱：k2/k1=exp(P1P2)/2反相色谱：k2/k1=exp(P2P1)/2 在液相色谱常用混合溶剂作流动相。混合溶剂的P具有加和性：Pab=aPabPb,为某一溶剂的体积分数。,溶

6、剂选择性分类,一般地说,改变溶剂比例可调节流动相的极性,从而使得组分的容量因子落在合适的范围内。但由于分子间相互作用的类型相同,分离因子变化不大。因此专门研究了各种溶剂的选择性,并将常用溶剂进行分类。,质子给予体,偶极相互作用,质子接受体,溶剂选择性分类三角形图,Xe,Xd,Xn,1,2,3,4,5,6,7,8,纯质子接受体,强偶极中性化合物,纯质子给予体,1 组：脂肪醚（纯质子接受体）2 组：脂肪醇（质子接受-给予体）3 组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化）4 组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体）5 组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距）6 组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈7 组：

7、芳烃、芳醚、硝基甲烷8 组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体）,质子给予体,偶极相互作用,质子接受体,反相色谱中的溶剂选择性,1,甲醇2,TFH3,4,5,乙腈6,7,水8,质子给予体,偶极相互作用,质子接受体,正相色谱中的溶剂选择性,醚 1,2,3,4,二氯乙烷 5,乙腈 6,7,8,CHCl3 8,主溶剂：己烷,按溶剂分子的特殊作用类型分类,采用三个不同的常数表示：Xe(接受质子参数)易与含羟基的分子作用(如酸类、酚类)；Xd(给质子参数)易与碱性化合物作用(如胺、亚砜等)；Xn(强偶极参数)易与偶极距较大的溶质分子作用(如硝基化合物、腈、亚砜和胺类等)。通常把常用溶剂分成八组。同一组溶剂的三

8、个选择性参数相近，其选择性相似。当某一溶剂不能提供足够的分离选择性时,那么更换同组的其它溶剂亦不能提高选择性。改变溶剂时,只有从距离较远的溶剂组挑选,才可能使选择性有较大变化。因为当溶剂和样品分子的各种相互作用的相对重要性发生明显变化时,流动相的选择性才会发生最大程度的改变。,流动相的优化,流动相的优化主要是考察流动相组成对保留时间、分离因子和分离度等参数的影响。使用混合溶剂最大优点是：获得最佳的分离选择性；保持流动相的低粘度,从而保证高的柱效。,在吸附色谱中混合溶剂选择规则：混合溶剂中极性强的组分含量大或小时,有最大的值；能与溶质发生氢键作用的溶剂,有较好的分离选择性。,4.流动相的组成,水

9、相 纯水 缓冲溶液有机相 纯有机相 混合有机相 缓冲有机相,对溶剂的要求,水：去离子水 自动纯水仪 重蒸水 重蒸水装置纯净水 商品瓶装水 有机溶剂:色谱纯（国产、进口、进口分装）重蒸旋转蒸发仪,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,水,有机溶剂,溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,水/MeOH梯度ODS 柱,1 ml/

10、min,0-100%MeOHover 10 mins and hold for15 mins.,鬼峰的出现,流动相溶剂的处理,水 将一般的蒸馏水，加入少许高锰酸钾，在pH910的条件蒸馏，可用于常规洗脱。用于梯度洗脱的水，应进行二次蒸馏。,不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。,有机溶剂的提纯 用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。氧化铝或硅胶柱可除去溶剂中的极性化合物。氯仿中（少量甲醇）先水洗，再蒸馏。四氢呋喃（抗氧剂丁基甲苯酚）而强烈吸收紫外线，可蒸馏。为了防止

11、爆炸，蒸馏终止时，在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。,过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意：1）每天脱气 2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长,过滤与脱气,流动相过滤器,负压抽吸,流动相的保存,保存于聚乙烯瓶中的超纯水,保存于棕色玻璃瓶中的超纯水,选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积

12、损坏色谱柱和使检测器噪声增加。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。,（）化学稳定性好,（）流动相同时还应满足检测器的要求。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波

13、长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。,色谱泵及液相色谱对泵的要求,稳定平滑并且重现性好的流速可靠且充分的溶剂混合准确及重现的自动溶剂混合准确及重现的梯度形成有效的流速范围制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注滞后体积仅仅应用于梯度实验目的：在任何情况下保持最高精度,常见液相色谱泵,串联式往复泵,并联式微体积往复泵,单向阀结构,单向阀原理,被动式单向阀,主动式单向阀(电磁阀）,梯度洗脱技术,梯度洗脱的特点梯度洗脱的主要条件梯度洗脱的基本原理,梯度洗脱（溶剂

14、程序）：通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。,为什么程序升温在液相色谱中没有受到青睐？,在液相色谱中最低温度和最高温度受到流动相的黏度和沸点的限制；同时它的温度效应比较小。,1梯度洗脱的特点,（1）改善分离,加快分析速度；（2）改善峰形,减少拖尾,有利于痕量组分的检测；,（3）增加峰容量；（4）强烈滞留的组分不容易残留在柱上,保持柱性能长期良好；（5）下次分析时,流动相需要一段平衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有差异,可能会引起基线漂移。,2梯度洗脱的主要条件,A 流动相/弱溶剂组成；B 流动相/强溶剂组成；梯度时间；梯度曲线：线性、凸型或

15、凹型等。,梯度洗脱的基本原理,建立了线性梯度洗脱方程：ln k=lnk0 b(t/t0)这里,k为梯度洗脱过程中任一时刻的容量因子；t为梯度时间；b为斜率-梯度连续变化的斜率；t0为死时间。,而洗脱时 k和k0 与溶液组成间的关系为：ln k=lnk0 S式中为强溶剂在洗脱液所占的体积分数；S是与强溶剂和试样有关的参数。对RPLC分离小分子，S一般为3-5。k0 为=0时的P值。结合上面二式,得,b=(St0)/t t0=V0/t 在梯度完成时,t=tG。此时,为A和B两溶液中强洗脱剂组成的差,即=,这时：b=V0/(tGF)/tG 为梯度变化速率,S值可由前式求得。可见,b值是可以求出的。求

16、出b值后,可以初步确定一下各种物质的k值,为更好地选择分离条件提供依据。,选择几个梯度洗脱时间tG,确定S值；确定tG下的最佳值(小的tG,大的流速)；可以进行非线性梯度洗脱,使欲分离物与其它物质尽可能分开；若分离效果不好,可以调整pH值、盐类型、有机溶剂组成等方法使分离物的峰与其它峰尽可能分开。,在全浓度范围内进行梯度洗脱,要确信欲分离物质在梯度变化范围内可以被洗脱，初步观察分离物的位置；确定梯度使用范围,的大小；,确定最佳化的梯度分离条件的实现步骤：,梯度操作注意事项：,两个流动相溶剂要能互溶，即极性不要相差太大吸附色谱只能是在小范围内变化，因此在吸附色谱中很少用梯度洗脱（为什么？）折射检

17、测器不适应于梯度洗脱（为什么？）,梯度：高压混合,高压梯度使用多台色谱泵，在泵后混合配置灵活、简单，脱气简单易调节梯度的滞后体积,梯度：低压混合,低压梯度用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积如设计不当，梯度的准确性受影响滞后体积（系统体积）设计合理,梯度洗脱,梯度滞后：系统体积的影响,注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路,梯度滞后大小的影响,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，

18、不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为24ml,滞后体积变化的影响,设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果：梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性,色谱柱的结构,色谱柱由柱管、填料、密封圈、过滤板、柱头等组成。应特别注意柱头规格及无死体积连接的特性。柱规格 制备柱 分析柱 微径柱液相色谱(Microbore HPLC)毛细管液相色谱(Capillary HPLC)快速柱：高效短柱，如4.630mm,3mODS柱,分离

19、模式的选择,样品,溶于有机溶剂,溶于水,溶于四氢呋喃,非离子化,离子化,溶于有机溶剂,溶于水,溶于正己烷,溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水,用硅胶的正相模式,用键合相的正相模式,用键合相的反相模式,用键合相的反相模式,低分子凝胶渗透色谱,用键合相的反相模式,抑制电离反相键合相色谱,离子对键合相的反相模式,用硅胶的正相模式,离子交换模式,凝胶渗透色谱,凝胶过滤色谱,大孔填料的离子交换模式,用大孔填料的反相模式,分子量2,000,分子量2,000,反相分配色谱 极性:固定相 流动相固定相-非极性流动相(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-极性非极性物质后出峰,正相吸附色谱 极性:固定相 流动相固

20、定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰,正相色谱 20%,反相色谱80%,正相&反相色谱,硅胶基质-pH 38 Al2O3.nH2O-pH114 聚合物基质-pH114,高或低pH下,硅胶会溶解,化学修饰困难,孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损,柱填料基质,C-18柱-性能影响因素,硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸 填料床的长度和内径颗粒形状 球型或不规则型粒径 平均颗粒直径,通常3-10m表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/gram表示孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300,色谱柱物理性质,C-18柱

21、-性能影响因素,键合类型 单体键合-键合相分子与基体单点相连 聚合体键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量封端 键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,色谱柱化学性质,C-18柱-性能影响因素,A类硅胶Original ZORBAX SIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾,B类硅胶(高纯)ZORBAX Rx-Sil(1987)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不发生拖尾,Zorbax Rx-SIL:11种金属 35 ppm(未检出其他杂质,1ppm);99.995%纯度的二氧化

22、硅,C-18柱-性能影响因素,色谱柱尺寸-对色谱分离的影响 短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低 长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长 窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高 宽径柱(3-21.2mm)-载样量高,C-18柱-性能影响因素,颗粒形状-对色谱分离的影响 当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时,球型颗粒可以降低柱压,延长色谱柱寿命,C-18柱-性能影响因素,球形,不规则形,粒径-对色谱分离的影响 较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5m的粒径,1.8m 3.5m 5m 7m 10m,表

23、面积-对色谱分离的影响 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力,柱容量和分离度.表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要,C-18柱-性能影响因素,孔径-对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品 MW 4,000,选择 80 的孔径样品 MW 4,000,选择 300 的孔径,大孔径填料适用于大分子分析,大孔径300 全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子Poroshell 色谱柱 高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽,色谱柱填料孔

24、径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配,300 孔径可改善蛋白质和多肽峰形,选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形,300 孔径可改善大分子的峰形,色谱柱:4.6 x 150 mm,5 mm 流动相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸 流速:0.75 mL/min 温度:RT 检测器:UV 282 nm,溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍,分子量虽小但 hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子,键合类型-对色谱分离的影响 单齿键合：提高传质速率,加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,增

25、加色谱柱的载样量,C-18柱-性能影响因素,碳覆盖率-对色谱分离的影响 高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间,封端-对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,C-18柱-性能影响因素,固定相键合二甲基硅烷,封端四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R=C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,+,+,Cl,CH,3,S

26、i,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3,(,TMS),传统键合及封端技术,取代基：五个 旁侧基团:异丙基,Zorbax StableBond 空间位阻保护-抗水解能力,键合相流失,保留减弱,另一个裸露的硅羟基,潜在的拖尾因素,普通硅胶柱低 pH 2不稳定,发生水解,空间位阻保护,液相柱-保留值与pH的关系,pH变化值0.1,RS变化值1.6,色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm,5um部件号：880975-906流动相：27%甲醇：73%磷酸pH 2.5&2.6温度：500C流速：1.0mL/min.,色谱柱:ZORB

27、AX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm,3.5 m流动相:44%25 mM磷酸,pH 7.00:56%甲醇流速:1.0 mL/min 温度:25C 检测:UV 250 nm,可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 甚至很小的 0.050.25 个pH变化单位.,样品:ketoprofen ethyl paraben Hydrocortisone fenoprofen propyl paraben Propranolol ibuprofen,液相柱-保留值与pH的关系,0.25 个pH,液相柱-保留值与pH的关系,pH变化：0.2个pH(7.07.2)保留时间改变：1

28、.2分钟(13.614.8分钟),保留时间随pH改变不明显,保留时间随pH改变不明显(酸性环境中),方法稳定区 方法波动区(pKa+1.5)方法稳定区,液相柱-保留值与pH的关系,液相柱-保留值与pH的关系,复杂组分的流动相pH选择技巧,色谱柱:ZORBAX Extend-C184.6 x 150 mm,5 mm 流动相:30%缓冲液:70%MeOH pH 7 缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速:1.0 mL/min 温度:RT检测器:UV 254 nm,0 5,1,2,3,4,5,Time(min),7,6,Extend-C18pH 7,1.Male

29、ate 马来酸盐 2.Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3.PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4.Doxylamine 抗敏安(多西拉敏)pKa 9.2 5.Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6.Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 7.Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0,Extend-C18pH 11,0 5 10,1,2,3,4,Time(min),6,5,7,高pH下,碱性成分的保留增加,待测物pKa+1.5以外的流动相pH可保证方法的稳定性,键合相-适用pH范围,低pH下,分析酸性,碱性和

30、中性组分,峰形优异,柱寿命长,中等pH下,分析酸性,碱性和中性组分,尤其碱性组分峰形优异,柱寿命长,中等pH下,分析酸性,碱性和中性组分,可用于100%全水相,尤其极性组分峰形优异,柱寿命长,中高pH下,分析酸性,碱性和中性组分,尤其碱性组分峰形优异,柱寿命长,柱性能测试:应指定色谱条件和检测物质,1理论塔板高度2峰不对称因子：应小于或等于1.23相对保留值和分配比的重现性：精密度应优于5%和10%4柱阻力因子：=0.1Pt0dp2(109L2)，多孔填料500-10005.折合塔板高度,1、对硅胶基键合相填科，水溶液流动相的pH值不得超出28.5的范围，温度不宜过高。2、柱子在酸性或碱性条件

31、下使用之后，应依次用水、甲醇清洗.3、对暂时不用而需要较长时间保存的柱子，要用纯甲醇清洗，柱子两端用金属螺帽封闭，保存于干净的有机溶剂中。,使 用 与 维 护,5、要防止流动相逆向流动，否则将使固定相层位移，柱效下降。,4、要防止色谱柱被振动或撞击，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。,色谱柱的在线保护装置,保护柱,1、除去柱上端固定相变色部分(约3mm左右)，再补充新的固定相。,2、色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适的溶剂进行洗净。,可能提高柱效的方法,3、采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来

32、得到再生。,液相色谱的检测器,常规检测器示差折光检测器（Refractive Index）紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis）荧光检测器（Fluorescence）蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering）其他检测器（Other Detectors）高端检测器光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array）质谱检测器（Mass Spectrometry）,HPLC检测器应提供的功能,对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是：由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间

33、关系的与线性偏离现象并不是所有的检测器是线性的受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距,用于HPLC的检测器,没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！HPLC检测器可以分为：溶质性质检测器（Solute property detectors）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）整体性质检测器（Bulk property detectors）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）,不同种类的检测器的分类,理想的HPLC检测器,高灵敏度；可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速

34、等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性,灵敏度：信噪比,灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更好的定量更好地完成色谱峰纯度/均一性,6:1,N,S,方法开发的过程,Adapted from:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;Practical HPLC Method Development 2nd Ed.,Wiley-Interscience,New York,1997,p.2,选择液相色谱的检测器,要考虑的因素：你要分离的化合

35、物/样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）梯度还是等度灵敏度需求是否有双检测的需求,选择液相色谱的检测器,通用检测器 RI ELSDMS灵敏度mgngpg线性范围104否103流速敏感是否是温度敏感是否否破坏性否是是,选择性检测器 ABSFLEC Cond MS灵敏度ngpgfgpgpg线性范围105103106105103流速敏感否否是是是温度敏感否否是是是破坏性否否是否是,可供选择的液相色谱检测器,Absorbance(UV/Vis)Chemiluminescence Circular Dichroism(Chiral)Conductivity E

36、lectrochemicalEvaporative Light ScatteringFluorescenceLaser Induced FlorescenceLaser Interferometer Laser PolarimeterMass Spectrometric(LC/MS),Nitrogen Specific Detector Nuclear Magnetic Resonance Offline MethodsOptical Rotation DetectorPhoto Diode ArrayRefractive IndexRadiochemicalSulfur Specific D

37、etector ViscometryMulti Angle Light Scattering,示差折光（Refractive Index）检测,示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）通常被认为是一种通用检测器检测溶液中所有被溶解的溶质 非特异性任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值,示差检测器 基本原理,检测基于被分析物的折光指数的差异测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别（Differential RI）典型的应用领域没有紫外吸收、荧光的化合

38、物，例如：碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers）脂肪酸（Fatty Acids）及油脂类（Lipids）,示差检测器的优、缺点,优点通用检测器容易使用；通常来说是比较耐用的检测器维护成本低缺点灵敏度低、选择性差对流速、温度及粘度的变化敏感不能用于梯度方法色谱峰可能是正的，也可能是负的,示差检测器的优点 通用性,根据随机统计；任何一对液体都会有大约0.07的折光率差异因此；除非正好被分析的样品与溶液的折光指数完全相同，都会被检测到,示差检测器的缺点 灵敏度,缺乏灵敏度 和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低,流动相：MeOH/H2O 60:40流速：1.0 mL

39、/min色谱柱：C18色谱柱温：30 C检测温度：35 C样品：Paraben Mixture,示差检测器的缺点 不适宜作梯度,流动相：A=CH3CN/H2O 75:25B=CH3CN流速：1.4 mL/min色谱柱：NH2色谱柱温：30 C检测温度：35 C,Chromatography Forum:Is RI with a Reverse Phase gradient possible?By XXXXXXXXX:I have a good separation of a multi-substituted,cyclohexane that fully resolves 12 differe

40、nt oligomers.I can detect the components by MS,but I would like to use a standard LC detector instead.There is virtually no adsorption above 230nm and below 230nm picks up solvent interference.Im considering using RI detection and afterward subtracting a blank run.Is there any hope of this working o

41、r would I be wasting my time?,示差检测器的缺点 对温度敏感,流动相 甲醇 0.25mL/minute检测器温度 35C；没有使用柱温箱,吸光度（Absorbance UV/Vis）检测,目前实验室中最流行的选择多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA）测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大,吸光度检测器（UV/Vis）优点,这种检测器简单、可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以,吸光度检测器

42、（UV/Vis）缺点,由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长受流动相组成的影响：用截止波长以上至少510nm作为工作波长缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响,背景吸收的影响,背景吸收降低了线性范围多数流动相有紫外吸收,背景吸收对紫外检测器噪音的影响,UV Spectrum of Eluents with 0.1%TFA Against HPLC Grade H2O Blank,溶剂混合的基线噪音,色谱条件色谱柱：C18,5 m,3.9x150mm at 35 C.流动相：

43、A:0.1%TFA in Water.B:0.1%TFA in Acetonitrile.梯度：5-40%B in 35 min.流速：1.0 mL/min.样品：水（10 L inj.vol.）检测：214 nm,为何如此重要？,五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。,基线噪音对积分的影响,荧光（Fluorescence）检测,发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即荧光,基态,激发态,S1,S0,激发（1）,振动能（2）,发射（3）,1.分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到

44、不稳定的高能量状态。2.电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。3.电子失去能量达到基态时发出荧光共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象,荧光检测器原理,荧光检测器的应用,环境中的污染物多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、饮料食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素染料维生素及衍生氨基酸生物技术及制药,氨基甲酸酯类杀虫剂,黄曲霉毒素,多环芳烃（PAH）,维生素,荧光检测器的优点,选择性提高灵敏度提高（在 pg/fg 范围）低背景技术,MDA及MDMA柱上200pgExcitation=280Emission=360,荧光检测器的缺点,不是所有化合物都有荧光，需要衍生检测器对溶解气体及其

45、他淬灭物质（如甲醇）敏感对Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂的极性和粘度、溶剂的pH值及样品浓度影响多数仪器的批次间差异较大，同一型号的不同荧光检测器会得到不同的结果。有的仪器信号及噪音大于另一台23倍，光电倍增管的特征是导致这个现象的原因。,溶剂中溶解的气体对响应值的影响,浓度对芘（Pyrene）最大激发波长的影响,From:Turro,N.J.,Modern Molecular PhotochemistryMenlo Park CA,Benjamin/Cummings Publishing,1978,蒸发光散射（Evaporative Light Scattering）,用氮气把流动相吹成细

46、雾状流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉蒸发的溶剂被从检测器中除去溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交被颗粒散射的光由光电倍增管（PMT）收集PMT的输出与溶质的存在量呈比例关系,蒸发光散射检测器原理,Evaporative Light Scattering简称：ELSD,ELSD 优点及应用领域,通用型 比流动相挥发性小的物质都能被检测可以作梯度实验；检测下限可到纳克级水平对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相应用领域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制药行业表面活性剂天然产物,ELSD 缺点,不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）要求使用雾化气源（典型

47、的是氮气）不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化破坏性技术蒸发出的溶剂要因到户外或通风橱里对挥发性化合物的检测不理想一般得到的是非线性校正曲线某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器,光电二极管矩阵（Photo Diode Array）,Photo Diode Array简称：PDA或DAD,PDA检测器 特点,三维水平的吸光度检测器,二极管矩阵检测器是在1982年首度出现的在整个UV-Vis带宽上检测吸光度都需要相应的软件进行数据的分析,PDA检测器的用途及要求,光电二极管检测器可以提供许多又用的功能光谱信息色谱峰纯度谱库拟合 像其他所有的UV/Vis检测器一样，需要：高的信噪比；好的线

48、性另外；还需要：光学分辨率光谱灵敏度及光谱分析软件,光学分辨率（带宽）,好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息,分辨率与色谱性能,高分辨率给出更多数据点（同样波长范围）高分辨率有更好的线性低分辨率的数据文件尺寸较小宽的光学带宽可以得到更高的光通量（灵敏度）,1.2 nm,14.4 nm,PDA的优点及缺点,优点通用的UV/Vis检测好的选择性、线性提供色谱峰的UV/Vis光谱图（峰确认）可提供纯度估计缺点低光学通量（较窄的带宽通量）与普通UV/Vis相比更复杂，容易漂移灯输出能量随时间降低,色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）,色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时

49、间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。,色谱峰,保留时间（分）,基线,峰高,峰宽,响应值,液相色谱图相关术语,色谱峰 Peak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线峰底 Peak Base峰的起点与终点之间连接的直线峰高 Peak Height峰最大值到峰底的距离峰宽 Peak Width在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半（高）峰宽 Peak Width at Half Height通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离,液相色谱图相关术语,峰面积 Peak Area峰与峰底之间的面积,又称响应值标准偏差；Standard Erro

50、r0.607倍峰高处所对应峰宽的一半拖尾峰 Tailing Peak后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰 Leading Peak前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰 Ghost Peak并非由试样所产生的峰；亦称假峰,液相色谱图相关术语,基线 Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线飘移 Baseline Drift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声；N Baseline Noise由各种因素所引起的基线波动谱带扩展 Band Broadening由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,液相色谱图相关术语,死时间，t0 Dead tim