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1、高效液相色谱定性定量分析方法,申海艳2012-11-10,色谱分析的目的：对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析 根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性定量分析。,液相色谱定性分析液相色谱定量分析影响定量分析的因素,色谱峰的定性鉴别：通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围在相同分析条件下 保留时间相同并不一定是同一组分 保留时间不同肯定不是同一组分,用“标样”的保留值定出被测组份的位置,标准加入法 将已知标准物质加到待测样品中，若某一峰增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使该峰增高，则可基本认定该峰与标准物质为同
2、一物质。DAD检测器 可同时比较保留时间和紫外光谱图。如果两项均一致，则可基本上确定为同一物质；如果保留时间一致，而紫外图谱有较大差别，则判定两者不是同一物质。,两谱联用技术1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和质谱对化合物进行定性，目前两用技术有：HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS,HPLC-NMR等。,液相色谱定性分析液相色谱定量分析影响定量分析的因素,确定样品的类型，主要成分/痕量成分使分析条件的分离度（R）大于：1.5色谱峰的定性，峰
3、一致性测定检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围用标样建立标准曲线检查方法的准确度及精确度用标样定期检查方法,定量分析的具体内容,准确度的衡量,色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失及杂质干扰等的因素，其结果同“标样”的准确程度关系密切一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的比较：相关系数相关系数：其中，X及Y分别代表不同方法的实验值及平均值,准确度的影响因素,标样的可靠性及其配制的准确度色谱方法的可靠性色谱泵的精确度（GPC的影响更大）进样器的准确度，进样技术,定量分析基本要求,要有纯物质做标准被定量组分峰要与其他组分达到基线分离符合定性参数要求选择合适定量方法,定量分析基本公式,在某些限定
4、条件下，被测组分的浓度与检测器的响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）Ci=fiAiCi=fiHi实际修饰公式为：y=ax+b,定量分析方法,面积归一化法标准曲线法内标法标准加入法,按测量参数分为峰面积法和峰高法,定量分析,色谱定量分析，峰高法和峰面积法的选择主要取决于检测器线性范围内，峰高和峰面积的准确性和重现性。归一化法最好选择峰面积法。标准曲线法、内标法和标准加入法可选择峰高法或峰面积法定量。,面积归一化法 不能作为准确定量的方法、仅在特殊情况下使用,公式：特点：各组分要全部流出、全部被检测，要求所有响应因子相当进样量不要求严格不需标样无需做校
5、正、简单、快速,标准曲线法,Ci=fiAi+a fi 为 i 组分工作曲线的斜率是实验室最准确的定量方法，定量较准确。,标准曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误。,注意的问题1 绘制标准工作曲线时，不同浓度的标准样品的数量一般不少于3个，多数取4-6个;2 标准样品的浓度间隔一般是等间隔，或两头稍密，中间宽些；3 待测组分浓度最好在标准工作曲线的中部，标准工作曲线一般不能外推；4 在扣除各种空白干扰后，一般可将原点视为标准工作曲线应通过的一点，即a值尽可能小。,标准工作曲线的绘制线性回归在色谱定量分析中检测器的响应值与待测组分浓度应呈线性关系，如无误差存在，
6、所有的点都应在一条直线上；实际上，由于随机误差不可避免，特别是误差较大，实验点较多时，要得到一条使所有实验点误差都最小的直线（最佳回归线），采用的方法是对数据进行回归分析，求出回归方程，再配线作图。当自变量为一个时称为一元回归。色谱定量分析中绘制标准工作曲线的过程就是一元线性回归方程的求解和配线过程。,线性回归方程 y=ax+bb称回归系数，是标准工作曲线的斜率；a是常数项，是回归直线的截距，此项应很小接近零；a值过大说明实验过程中有系统误差。回归直线就是在所有直线中使差方和（各数据点的误差的平方的加和）最小的那条直线，即回归直线的系数a和常数b项应使差方和达到极小值。此求回归直线的方法通常被
7、称为最小二乘法。,相关系数用来表示线性关系的好坏程度；相关系数越接近1，说明线性关系越好；绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。如达不到要求，可能存在以下原因：所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器 响应值的线性范围；实验数据的精密度太差，过于分散。无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线。,适合大量样品的分析；不需要所有组分都流出或被检测到。,需要标准品 进样量要准确 仪器稳定性良好 每次样品分析的色谱条件很难完全相同，容易出现误差 绘制标准工作曲线一般使用待测组分的标准样品，对样品前处理过程中待测组分的变化无法进行补偿。,缺点,单点校正法 当
8、待测组分含量变化不大，且已知这一组分的大概含量时，也可不必绘制标准工作曲线，而是选取和待测组分含量相近的已知浓度的标准溶液，定量进样，根据被测组分和外标组分峰面积比或峰高比计算被测组分含量。,单点校正法误差较大。,单点校正法 1 单标单试 即一个标样一个试样，但是每个标样和试样都要做两个平行试验，并且要求进样时，每个样品平行进两针，取峰面积或峰高的平均值进行计算。2 双标双试 即两个标样两个试样，相当于每个标样和试样做两个平行试验，并且要求进样时，每个样品平行进两针，取峰面积或峰高的平均值进行计算；计算时分别对标样进行互标，并且分别用两个标样计算两个试样的含量；如果标样互标和用两个标样计算两个
9、试样的含量都在误差范围之内，就算试验成功。,内标法选择适宜的物质作为欲测组分的参比物，定量加到样品中去，依据欲测组分和参比物在检测器上的响应值（峰面积或峰高）之比和参比物加入的量进行定量分析的方法。内标法与标准曲线法相比，有利于消除色谱条件不完全重现、进样量不准确等所带来的误差。,内标法特点：,进样量不要求严格、进样量变化、色谱条件的微小变化对内标法定量结果影响不大；在样品前处理前加入内标物，再进行样品前处理，可部分补偿待测组分在样品前处理时的损失。内标法定量比标准曲线法定量的准确度和精密度都要好。只对所测组分做校正 必须在样品中加一内标组分 操作较繁琐 内标物选择困难,选择内标物注意事项,理
10、化性质与待测物接近 在样品中不存在且不与样品组分发生化学反应 内标物与待测物相应接近 与待测物有良好分离，但又不能相距太远 与待测物峰面积比为 最好，因此要根据待测物 浓 浓度确定内标物的添加量。,标准加入法 也称叠加对比法实际上是一种特殊的内标法，是在选择不到合适的内标物时，以待测组分的纯物质作为内标物，加入到待测样品中，然后在相同的色谱条件下，测定加入待测组分纯物质前后待测组分的峰面积（或峰高），从而计算待测组分在样品中的含量。,标准加入法特点,不需另外选择内标物进样量不必十分准确，操作简单两次色谱条件完全相同以保证校正因子完全相同如在样品前处理前就加入已知准确量的待测组分，则可完全补偿待
11、测组分在前处理过程中的损失。,液相色谱定性分析液相色谱定量分析影响定量分析的因素,影响定量分析的因素,样品制备干扰物质尽可能的分离出去；样品中的待测组分能否尽可能多的转入制备好的样品溶液中；样品制备和储存过程中防止损失和被玷污采用衍生化技术时，反应一定是定量的。,进样技术 采用归一化法、内标法和标准加入法时，进样的误差可以被这些方法的本身的特性所消除；进样对标准曲线法定量分析的影响主要有以下两个因素：a 进样装置的准确性和精度b 分析人员对进样技术掌握的熟练程度,色谱条件的选择 1 在分离度良好的条件下，柱效的变化对峰面积定量没有 影响，对峰高定量会产生影响；2 流动相流速变化对归一化法、内标
12、法和标准加入法定量结果无影响，但对标准曲线法的定量结果有影响，而且其对峰面积定量结果的影响比对峰高影响大，因此，在流动相流速不易控制时，如采用标准曲线法定量，宜采用峰高法定量；3 气相色谱中，柱温会影响保留时间和峰高，且其对峰高的影响随分子量的增加而增大。但柱温对峰面积大小影响较小，所以在气相色谱中多采用峰面积定量。,检测器特性检测器工作的稳定性和线性范围将直接影响色谱定量分析结果的准确性和重复性 1 进样量不能使待测组分的响应值超出检测器的线性范围，选用的进样量最好能使检测器的响应值落到其线性范围的中间部分，此时误差最小 2 选择适当的检测器和检测器的工作参数，使定量分析结果由检测器引起的误差降到最低。,欢迎您！,黄河三角洲京博化工研究院,
