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1、2023/10/6,固相萃取技术,1,固相萃取,2023/10/6,2,固相萃取技术,目录,前言固相萃取的原理萃取的装置萃取的类型萃取的操作步骤萃取使用条件的选择最新装置应用展望,2023/10/6,3,固相萃取技术,前言,固相萃取（SPE）是一种样品前处理技术，它建立在传统的液-液萃取（LLE）基础之上，结合物质相互作用的相似相溶机理和目前广泛应用的HPLC、GC中的固定相基本知识逐渐发展起来的。具有有机溶剂用量少、便捷、安全、高效等特点。在环境分析、药物分析、临床分析和食品饮料分析中得到广泛的应用。,2023/10/6,4,固相萃取技术,借助SPE所要达到的目的,（l）从试样中除去对以后的
2、分析有干扰物质；（2）富集痕量组分，提高分析灵敏度；（3）变换试样溶剂，使之与分析方法相匹配；（4）原位衍生；（5）试样脱盐；（6）便于试样的储存和运送。,液体试样,2023/10/6,固相萃取技术,5,一、固相萃取的原理,SPE 技术基于液相色谱的原理，可近似看作一个简单的色谱过程。SPE法是根据被萃取组分与样品基质及其它成分在固定相填料上作用力强弱的不同而使它们彼此分离。,2023/10/6,固相萃取技术,6,定 义,（一）通过样品中的待测成分及杂质在液相与固定相之间的相互作用的不同而达到分离的方法。（二）固相萃取法是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理，使液体样品通过吸附剂保留
3、其中某一组分，再选用适当溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。,2023/10/6,固相萃取技术,7,基本概念,保留和洗脱 容量和选择性,2023/10/6,固相萃取技术,8,保留和洗脱,“保留”是一种存在于吸附剂和分离物分子间吸引的现象，造成当样品溶液通过吸附剂床时，分离物在吸附剂上不移动。“洗脱”是一种保留在吸附剂上的分离物从吸附剂上去除的过程，这通过加入一种对分离物的吸引比吸附剂更强的溶剂来完成。,2023/10/6,固相萃取技术,9,容量和选择性,吸附剂的容量是在最优条件下，单位吸附剂的量能够保留一个强保留分离物的总量。Csp=保留化合物量(mg)萃取
4、填料质量（100mg）选择性是吸附剂区别分离物和其他样品基质化合物的能力。,2023/10/6,固相萃取技术,10,固相萃取的简要过程,（1）一个样品包括分离物和干扰物通过吸附剂；（2）吸附剂选择性地保留分离物和一些干扰物，其他干扰物通过吸附剂；（3）用适当的溶剂淋洗吸附剂，使先前保留的干扰物选择性地淋洗掉，分离物保留在吸附剂床上；（4）纯化、浓缩的分离物从吸附剂上淋洗下来。,2023/10/6,固相萃取技术,11,二、固相萃取的装置,SPE装置由SPE小柱和辅件构成。SPE 柱的组成和形式。SPE辅件一般有真空系统、真空泵、吹干装 置、惰性气源、大容量采样器和缓冲瓶。进行方式：在线和离线 S
5、PE,2023/10/6,固相萃取技术,12,1、SPE柱,柱管由血清级的聚丙烯制成，一般做成注射器形状。烧结垫除了能固定固定相外，还能起一些过滤作用。固定相是 SPE 柱中最重要的部分。粒径一般为40-60m或80-100 m。,SPE柱由三部分组成：柱管、烧结垫、固定相。,2023/10/6,固相萃取技术,13,2、柱形式,SPE柱（cartridge）最普遍使用的形式 一次性使用SPE盘（disk）固相微量萃取（solid phase microextraction,SPME）,100mg/1ml、200mg/3ml、500mg/3ml、1g/ml,膜片性固相萃取柱,膜片状SPE材料是以
6、聚四氟乙烯纤维薄膜为骨架，纤维之间载有很小的色谱吸附剂颗粒（直径约为12 m）。萃取膜中，90%是SPE吸附剂，10%是聚四氟乙烯纤维。吸附剂分为硅胶颗粒和聚合物颗粒。,膜片型SPE柱的显著优点,提高检测灵敏度减少样品体积避免浓缩步骤，可以直接进行HPLC分析,96孔板是高通量的SPE产品，每孔含少量吸附剂（10-100mg），样品载量约2ml/孔，主要用于生物、医药等行业小量的多样品的净化处理，且多与自动化的样品处理装置连用。其基本原理和使用方法于SPE柱相似。,固相萃取板,固相萃取吸嘴,以一次性移液器吸嘴为吸附剂承载体，吸嘴内装填固相萃取吸附剂。SPE吸嘴主要有两种形式：吸嘴尖部填充有固相
7、萃取吸附剂和固相萃取材料涂布在尖嘴内壁上。SPE吸嘴操作简单，便于自动化，在蛋白质组学的结构分析上应用广泛。,2023/10/6,固相萃取技术,18,Orochem固相萃取装置及小柱,产品编号：C11001 原产地：美国Orochem 仪器介绍：各种规格的SPE小柱及SPE抽真空装置，适合蛋白质组及DNA/RNA样品纯化的各种96孔板，氮吹浓缩仪，全自动样品加样系统等。,2023/10/6,固相萃取技术,19,3、真空处理装置,1.SPE 柱；2.真空表3.安全阀;4.抽空橡管5.定位槽；6.定位轴7.缸体；8.下支架；9.上支架；10.试管(24 支）；11.支脚；12.上盖；13.放空阀；
8、14.插管头（12 个）；15.封堵头（12 个）,2023/10/6,固相萃取技术,20,4、固相萃取装置图,2023/10/6,固相萃取技术,21,三、萃取的类型,键合硅胶-SPE 聚合物吸附剂-SPE 免疫亲和吸附剂-SPE 分子嵌入聚合物-SPE,2023/10/6,固相萃取技术,22,萃取类型-键合硅胶SPE,键合硅胶-SPE 最常用的吸附剂是表面键合 C18 的多孔硅胶颗粒或其他亲水烷基。键合硅胶是通过有机硅和活性硅的反应形成的。最通常使用的非极性吸附剂是十八硅烷（octadecyl silane）键合到硅基质上叫C18。,正相固相萃取：极性固定相(以硅胶为载体的二醇基、丙氨基小柱
9、)从样品中萃取有机酸、碳水化合物和弱阴离子极性物质。被萃取的极性化合物在固定相上的保留强弱取决于其极性基团与固定相表面极性基团之间的相互作用(氢键、-键、偶极间相互作用等)。,反相固相萃取：非极性或弱极性固相柱(硅胶载体表面键合疏水性烷基)适用于萃取非极性至中性等极性的化合物，被萃取物与固定相之间主要是基于范德华力和疏水相互作用。,离子交换固相萃取：以离子交换剂(在硅胶表面接上季铵基、磺酸基、碳酸基)为固定相萃取有机和无机离子性化合物，被萃取的离子因与固定相表面的离子交换基团之间存在静电相互作用而保留。,2023/10/6,固相萃取技术,26,萃取类型-聚合物吸附剂-SPE,聚合物吸附剂-SP
10、E在一些方面弥补了硅胶键合-SPE的不足。一种新型的聚合物反相吸附剂-聚合二乙烯苯-N-乙烯吡咯烷酮。,2023/10/6,固相萃取技术,27,萃取类型-免疫亲和吸附剂-SPE,抗体对抗原的键合是空间互补性的结果，是分子间加和的一个功能，这意味着抗体也能键合到结构和抗原相似的其他分析物上，称为交叉反应性。为了避免非特定的相互作用，选择性吸附剂是非常重要的，这种吸附剂应该是化学和生物惰性、易活化和有亲水性。,2023/10/6,固相萃取技术,28,萃取类型-分子嵌入聚合物-SPE,分子嵌入聚合物（MIP）是高稳定的聚合物。在模板和分子间选择性依靠氢键、离子和亲水性相互作用。必须从聚合物上去除模板
11、分子。,固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理,固相萃取装置之所以能将目标化合物从样品基质中分离出来，主要是靠固相吸附剂上的官能团与目标化合物的官能团之间的作用力将目标化合物保留在固相吸附剂上，而没有被保留的样品基质则通过固相萃取装置。非极性作用力、极性作用力、离子作用力、共价作用力等。,非极性作用力,对于键合硅胶和聚合物吸附剂而言，非极性吸附力产生于固相萃取材料官能团上的碳氢键和目标化合物的碳氢键之间，即是范德华引力或散射力非极性作用力最弱，一般在1-5kcal/mol常被用于从样品基质中吸附分离具有非极性结构的目标化合物常用于反相萃取,极性作用力,极性作用力发生在固相萃取材料极性表面与目
12、标化合物 的极性官能团之间，常见的极性官能团有羟基、胺、巯基、羰基等包括氢键、诱导偶极力等强度中等，在1050kcal/mol用于正相萃取,离子作用力,离子作用力发生在带相反电荷的目标化合物与固相萃取吸附剂官能团之间。离子作用力的强度是三种作用力中最强的，选择性最好的，为50200kcal/mol用于离子交换固相萃取,共价作用力,共价作用力发生在共价填料与目标化合物之间，共价键不容易被打断，但有的官能团形成的共价键在改变溶剂环境的条件下是可逆的，例如，苯硼酸基。共价作用力选择性强，但是由于其特殊性，实际应用中较少采用,2023/10/6,固相萃取技术,34,四、萃取的操作,预处理加样除去干扰杂
13、质分析物的洗脱和收集,经典固相萃取模式,2023/10/6,固相萃取技术,36,柱预处理,柱预处理有两个目的：一个目的是除去填料中可能存在的杂质；另一个目的是使填料溶剂化，提高固相萃取的重现性。,2023/10/6,固相萃取技术,37,加样,加到萃取柱上的试样量取决于：萃取柱的尺寸（填料量）和类型 在试样溶剂中试样组分的保留性质 试样中分析物 基质组分的浓度等因素,2023/10/6,固相萃取技术,38,除去干扰杂质,通过调节清洗溶剂的强度和体积，尽可能多地除去能被洗脱的杂质。根据不同强度下分析物的洗脱廓形，决定清洗溶剂合适的强度和体积。,2023/10/6,固相萃取技术,39,分析物洗脱和收
14、集,这一步骤的目的是将分析物完全洗脱并以最小体积收集，同时使比分析物更强保留的杂质尽可能多地仍留在 SPE 柱上。洗脱溶剂的强度是至关重要的。,2023/10/6,固相萃取技术,40,提高SPE的重现性,影响SPE重现性的主要因素是实验条件。提高方法：（1）使用内标法，加入适当的内标作参比；（2）加入样品量适当，不超出穿透量和穿透体积；（3）选择合适的洗涤液和洗脱液，确保分析物在操作中不流失。,固相萃取技术,41,2023/10/6,五、萃取条件的选择,固定相的选择 选择原则 影响因素溶剂的选择,固相萃取技术,42,2023/10/6,固定相的选择原则,凡是极性基体中含有待分析脂溶性化合物都可
15、以用反相柱处理。对于含有极性基团的脂溶性化合物，可用极性的键合固定相处理。对于含有可电离的离子基团的有机物，如果碳键很长或碳数很多，可直接用反相固定相处理；如果在反相柱中保留很小，则可采用反相离子对萃取；对于含有多种离子基团的有机物，则用离子交换固定相。,固相萃取技术,43,2023/10/6,固定相的选择原则,如果样品组分中同时含有离子型化合物和中性分子，可采用离子对SPE萃取，当然也可以分别处理。非极性基体中的极性化合物，要用正相固定相萃取，其中基体也可以是弱于所萃取物的弱极性溶液。对于离子性的化合物，象无机离子等，包括反相离子对SPE不能解决的，就要采用离子交换固定相。,固相萃取技术,4
16、4,2023/10/6,影响因素,分析物在极性或非极性溶剂中的溶解度；分析物有无可能离子化；分析物有无可能与固定相形成共价键；不需要的组分与分析物在固定相结合点上的竞争程度。,固相萃取技术,45,2023/10/6,溶剂的选择,萃取的不同步骤对溶剂的要求不同。预处理-初溶剂应与洗脱溶剂一样强或强于洗脱溶剂；终溶剂应该与样品溶剂性质相似 加样-溶解样品的溶剂必须较弱 淋洗-淋洗溶剂要略强于或等于上样溶剂，但不能强到可以洗脱任何一个分析组分的程度 分析物洗脱-选择的溶剂不能太强,上样流速和洗脱流速会影响吸附或解吸附、洗脱的效果，上样和洗脱的流速一般控制在1mL/min以内。对于大样量痕量样品的富集
17、，如环境水样中有机物的富集，上样最大流速不超过5mL/min。除了以上的几个因素，一些操作步骤完成的情况，如活化的程度、淋洗步骤等，也会影响结果的回收率或重现性。,流速,对于离子交换固相萃取来说，目标化合物与干扰物质的pKa各不相同。通过调节溶剂pH的大小，可以使固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带电荷；或使固定相带电荷，干扰物质带相反电荷，而使被分析物不带电荷。,pH值,2023/10/6,固相萃取技术,48,六、最新装置,美国Supelco公司专利产品固相萃取（SPE）装置,2023/10/6,固相萃取技术,49,大体积进样器 真空处理装置,2023/10/6,固相萃取技术,
18、50,12或16或24管 SPE真空固相萃取装置,供应公司：上海泉岛科贸有限公司 简单介绍：用于SPE的批量处理，提高实验的重复性和效率,2023/10/6,固相萃取技术,51,吉尔森单通道全自动固相萃取仪,产品编号：C10348产品型号：ASPEC XL原产地：法国特点：1.可处理108个样品 2.15个无限量溶剂及12个250ml试剂瓶 3.可选配在线浓缩功能 4.可实现分步收集,2023/10/6,固相萃取技术,52,吉尔森四通道自动固相萃取仪,型号：ASPEC Xli自动处理108个样品，同时平行进行四个样品的固相萃取 高处理量，适合LC-MS及GC 使用1ml和3ml标准SPE柱 处
19、理后的样品可转移至普通试管、密封的标准2ml自动进样瓶以及96孔反应板 可在4-40范围控制温度,2023/10/6,固相萃取技术,53,SPE 215多通道固相萃取系统,医药/环保/刑事鉴定中自动样品前处理自动进行固相萃取，可多组份收集无人为影响，无乳化，少溶剂高回收率，高重现性，高效率,用于各种商品萃取柱自动记录资料，便于GLP管理 可连接HPLCGCGCMS 处理大量样品可选ASPECXL4,2023/10/6,固相萃取技术,54,固相萃取自动工作站,产品编号：C10928产品型号：Auto Trace,Rapid Trace原产地：美国,2023/10/6,固相萃取技术,55,技术参数
20、 1.计算机程序控制 2.使用正压泵，加快萃取速度 3.可以配合自动浓缩工作站使用，自动浓缩萃取出来的样品主要特点 1.计算机程序控制 2.可以同时处理多达6个水样 3.可以使用至少4种淋洗液 4.降低劳动力费用 5.减少暴露在危险试剂前的机会,2023/10/6,固相萃取技术,56,全自动固相萃取系统,产地：美国Horizon公司 型号：SPE-DEX4790,2023/10/6,固相萃取技术,57,主要特点：1.预先编程安装好的EPA标准方法，可以修改参数从而发展新方法2.全自动传送所有必须溶剂;自动直接在原始样品瓶中处理样品;3.彻底全面自动清洗样品瓶;4.自动把SPE过滤盘得到的萃取物
21、传输到收集瓶中;5.自动清洗萃取器，为处理下一个样品作准备。,2023/10/6,固相萃取技术,58,全自动样品净化系统和固相萃取仪,产品编号：C11396 产品型号：Power-Prep/GPC 主要特点1.单一样品净化2.错误少，回收率高3.自动运行，无需照看4.增加分析速度和精度5.溶剂消耗量低,2023/10/6,固相萃取技术,59,七、固相萃取的应用,环境化学分析中的应用 药学应用 生物样本分析,2023/10/6,固相萃取技术,60,环境化学分析中的应用,水中污染物的分析 农药 富集痕量有机化合物 酚类,2023/10/6,固相萃取技术,61,水中有机污染物分析,近年来随着化学工业
22、的发展和农药的大量使用导致自然环境中某些水体、土壤、大气和生物体中有机污染物超过法定限量。固相萃取作为一种新型的样品处理技术已广泛用于水中有机污染物的痕量富集。SPE 中使水样通过固相萃取小柱，分析物吸附到固定相上，然后通过热脱附或用溶剂将分析物洗脱下来，浓缩、定容、分析。,2023/10/6,固相萃取技术,62,水中污染物的分析 多环芳烃,多环芳烃是在自然界中广泛存在的一类有机污染物。其中某些化合物具有相当强的致畸、致癌或致突变作用，它们在水体中似乎都存在，而且含量低、种类多，对其进行快速、准确地定性定量一直是分析化学的前沿研究领域。与经典的液-液萃取（LLE）相比，固相萃取具有节省时间、溶
23、剂用量少，不易乳化等特点。淋洗剂强度、用量和有机改性剂的加入对固相萃取水中多环芳烃回收率的影响。,见文献,2023/10/6,固相萃取技术,63,水中污染物的分析 多氯有机化合物,以往分析环境水样中微量有机物时，根据污染物的极性、挥发性和高温稳定性等选择GC或HPLC进行分析，但水样必须经过分离、富集、纯化等前处理，例如，常采用液-液萃取、蒸馏、结晶、过滤、预沉淀、离心等方法。这些步骤繁琐、耗时，约占整个分析过程的三分之二时间，也是不同实验室间误差的主要来源。使用固相萃取技术则克服了上述前处理的缺点，该技术设备简单、价廉、使用溶剂少、高效率、有选择性地分离和富集不同的样品。董玉瑛采用 SPE和
24、GC/ECD离线联用技术对长江南京段水体中痕量多氯有机化合物(PCOCs）进行了分析。,2023/10/6,固相萃取技术,64,农 药,有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农药是目前国内常用的三大类农药，在生产、运输和使用过程中可能会引起中毒或环境污染。以往报道固相萃取、净化方法和各种仪器的分析鉴定方法仅局限于某类农药，而建立多类农药同时通过固相萃取和气相色谱进行分析，对于毒物分析、临床急救都具有实际意义，为系统分析有机农药提供一种简便、快速的固相提取方法。孙静研究了用国产 GDX-403或C18固相小柱同时提取净化环境样品和生物检测中常见的三类农药:六种有机磷类、四种氨基甲酸酯类和五种拟除虫
25、菊酯类农药。,2023/10/6,固相萃取技术,65,富集痕量有机化合物,固相萃取富集环境空气中有机物是将均匀粒度的固定相装成小柱，在常温或低温下使空气通过小柱，由于气相（空气）与固定相之间对有机化合物的分配系数不同而将欲捕集的化合物保留在小柱上，空气中正常组分如氮，氧等则通过小柱流出，达到富集有机化合物的目的。本方法适合环境空气，污染源和污染事故监测采样，由于操作简单，复盖污染物多，特别适合污染事故采样取证。张莘民等曾采用活性炭小柱（内装0.3g）萃取富集环境空气中的氯仿、四氯化碳、一溴二氯甲烷、二溴一氯甲烷、三溴甲烷五种卤代烃化合物。,2023/10/6,固相萃取技术,66,酚 类,由于酚
26、类化合物毒性较大，美国EPA已将11种酚类化合物列入优先监测的有机污染物。采用固相萃取（SPE）水中ng级的酚类化合物，结合 HPLC/紫外检测器分析，无需衍生化即可使苯酚等 11 种酚类化合物获得良好的分离和灵敏地检测。采用衍生化法检测酚类化合物，既可以改善其柱上行为，又可以提高检测的灵敏度，使用五氟丙酸酐作为衍生化剂比乙酸酐具有更大的电负性，因而可进一步提高检测的灵敏度。陶钢报道采用衍生化法测定水中的苯酚、3，5-二甲酚和3，4-二甲酚。,2023/10/6,固相萃取技术,67,药学应用 中药分析,在中药分析中，由于含量低微且共存成分相当复杂，供试液分离纯化有很大的困难，严重制约了分析的专
27、属性和重现性。中药分析的瓶颈需要突破，固相萃取法在供试液的分离和纯化上，以传统的液-液萃取所无法比拟的优势，开始担当着越来越重要的角色。缺点：首先，技术上的障碍在于当前中药分在这方面缺乏技术指导、可供借鉴的经验不多；其次，现代商品小柱针对环保、体内药分等，填料量偏小难于适应中药分析的需要，使应用效果不理想；第三，开展现代固相萃取技术的成本，包括添置相关的器件与装置，比传统的液液萃取门槛高。,2023/10/6,固相萃取技术,68,药学应用 药物中毒,巴比妥类三环类抗抑郁药物局麻药,2023/10/6,固相萃取技术,69,生物样本分析,SPE 技术与 LLE 技术相比，在生物样本分析方面确有较多
28、优势，因而近年来应用不断增多。Okazaki等研究奥弗拉辛及其二甲基和 N-氧基代谢物时，比较了SPE和LLE的提取回收率。Wells 等为了研究布美他尼的药动学，从新生儿体内取得0.2ml血浆及尿样进行分析。Lu 等以 SPE-柱后光反应的HPLC荧光检测法测定了血浆中痕量的甲氨喋呤和7-羟基甲喋呤。,2023/10/6,固相萃取技术,70,HPLC紫外检测方法测定健康人体中齐多夫定含量的方法,精密取血样015 mL置115 mL具塞离心管中,精密加入内标液50L,涡旋振荡1 min,备用,固相萃取小柱依次用甲醇1 mL、水1 mL活化,取1 mL上述备用品上样。用水1 mL,体积分数5%甲
29、醇1 mL淋洗,弃去,最后用甲醇0.5 mL洗脱测定物收集洗脱液进样20L。,齐多夫定-合成类核苷类似物，用于艾滋病治疗,2023/10/6,固相萃取技术,71,应用高效液相色谱和固相萃取技术测定食品中的苏丹红一号,固相萃取净化步骤苏丹红一号在C18萃取小柱上不保留,而多数干扰物质却可以保留在小柱上。本实验的净化过程正是利用苏丹红一号的这种特性。具体操作时,先用10 ml甲醇活化C18小柱,当小柱中甲醇液面降至约2 mm 时,将过滤后的样液倒入萃取柱。当样液流出约2 ml后,收集样液3 ml于5 ml试管,最后用针筒式微孔滤膜过滤器过滤于1 ml的样品小瓶中,进样测定。,2023/10/6,固
30、相萃取技术,72,八、总结和展望-与LLE相比SPE法的优点,（l）分析物的高回收率；（2）更有效地将分析物与干扰组分分离；（3）不需要使用超纯溶剂，有机溶剂的低消 耗减少对环境的污染；（4）能处理小体积试样；（5）无相分离操作，容易收集分析物；（6）操作简单、省时、省力、易于自动化,2023/10/6,固相萃取技术,73,展望,SPE 技术操作简便、快速，溶剂用量少，重现性好，易与 GC、GC/MS、HPLC等仪器联用，是一门很有潜力的预处理技术。根据实际的需要，今后的发展方向是使用范围广、选择性高、容量大、易操作和易自动化的固相萃取固定相和装置。,2023/10/6,固相萃取技术,74,知识回顾,固相萃取的原理萃取的装置萃取的类型萃取的操作步骤萃取使用条件的选择应用,2023/10/6,固相萃取技术,75,主要参考资料,1刘俊亭，王文彬.固相萃取法命名的由来与发展.色谱.1994,012(005):388-3992马娜，陈玲等.固相萃取技术及其研究进展.2002。3程雪梅.色谱分析样品前处理技术固相萃取法.2002。4刘长武,翟广书等.固相萃取技术的原理及进展.2003。5楼蔓藤，商振华.固相萃取技术的发展与应用.1998。6赵进英，李金昶.固相萃取技术及其在环境分析中的应用.化学工程师.2002。,
