《禽流感核酸检测考核结果汇报.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《禽流感核酸检测考核结果汇报.ppt（47页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、2007年禽流感核酸检测考核结果汇报,1,2,核酸检测是禽流感检测的一种重要手段 快速、灵敏、特异性高多种因素影响检测的结果 标本的采集 核酸的提取 反应体系的优化，包括引物探针的设计，试剂的选择 熟练的操作 良好的实验室管理,3,2005年以来中国大陆H5N1 人禽流感确诊病例实验室诊断,4,2006年核酸考核：参考品制备和网络实验室评价检测。制备标准品包括：病毒裂解液、体外转录RNA、样品包括不同检测的灵敏度设灰色检测区、统一配发核酸提取试剂和引物。2007年核酸考核：了解各省禽流感核酸检测能力 考核标本：病毒裂解液、不同时发放核酸提取试剂和引物,流感网络实验室核酸考核进程,07年考核目的
2、,深入了解各省份禽流感核酸检测能力的基本情况。了解各省禽流感核酸检测工作中可能存在的实际问题。了解核酸检测工作的不足并确定下一步的工作重点。,5,组织形式,本次考核由中国CDC发文，国家流感中心执行。本次考核定位为基础水平考核，并附有情况调查表。本次考核标本发放全国31个省（自治区、直辖市）的流感网络实验室，考核时间为1个月。本次考核内容为鉴定10份盲样的型别及亚型。,6,考核标本的设计,考核标本共10份盲样，均为病毒裂解液。分别为禽流感H5N1标本4份，H9N2标本1份，H3N2和B型混合标本1份，H1N1标本1份，B型标本1份，阴性标本2份，病毒浓度均控制在易检范围之内。,H5N1标本为病
3、毒原液10-1-10-4的梯度稀释，以此结果来判定核酸检测的灵敏度是否合格；H3N2标本混有B型，此项内容考核结果判定；阴性标本考核是否有交叉污染出现。,7,所用毒株名称：H1N1:A/Jiangsuxinghua/33/2007H3N2:A/Jiangsuguangling/316/2007B:By/Fujianggulou/1774/2007H5N1：A/Xinjiang/1/2006(H5N1)H9N2:A/chicken/Foshan/48/98(H9N2),8,9,考核标本的定量结果,10,考核标本的制备,1.稳定性检测：冰盒内室温4天。冰盒内室温4天，后-20度2周。2.可重复性验
4、证：不同仪器 不同操作人 不同标本抽样,运输和结果提交情况,国家流感中心,11,考核结果,22个省份结果正确，河北、辽宁、黑龙江、云南、贵州五省H3N2+B标本由于实验思路不同未检出B型，黑龙江未检测出H3,用AN2引物检测出N2亚型。陕西没有检出H9只检出了N2。宁夏、贵州两省H5N1 的10-4稀释度标本未检出。广西首次H5N1与H9N2均未检出，第二次提交全部正确。阴性标本均无问题，没有污染情况发生。,国家流感中心,12,考核结果分析,完整的标注应当有样品名，引物名，片断大小，Marker梯度等等。,13,考核结果分析：实验结果标注不清,很多省份标注不够规范。,国家流感中心,14,考核结
5、果分析,国家流感中心,15,考核结果分析,Realtime结果应该有两个图，一个应包含阳性曲线和域值线的情况并标明所用引物和样品名称，另一个应包含机器显示的CT值。,16,我们发放的禽流感引物和人季节性流感引物在同种亚型之间是可能存在交叉的，7号其实是H3N2标本。,考核结果分析：引物交叉情况说明,H9N2的N2引物与H3N2的交叉情况,17,考核结果分析：引物交叉情况说明,甲型鉴定引物的交叉情况,18,考核结果分析：鉴定的思路,国家流感中心,19,考核结果分析：鉴定的思路,国家流感中心,20,考核结果分析：鉴定的思路,21,考核结果分析：RT-PCR,国家流感中心,22,考核结果分析：RT-
6、PCR,23,考核结果分析：Realtime结果,所提交的结果当中25个省份做了realtime，其中18个省份结果较好,主要存在的问题：实验体系没有对照。对仪器操作不够熟悉。,24,考核结果分析：Realtime结果,25,考核结果分析：Realtime结果,26,下一步工作方向,进一步完善和优化鉴定引物。进一步优化反应体系。优化实验和结果判定方案。,27,实验室管理,PCR仪器配置情况,常用试剂及耗材供应商情况,个人防护设备,检测标本的内容及检测方法的应用,调查结果,问卷调查情况,1.各省级CDC PCR仪器配置情况,仪器设备非常好上海市、浙江省、广东省（PCR仪三台，Real-time
7、PCR仪两台）仪器设备较好黑龙江、安徽、江西、甘肃、宁夏回族自治区（两种类型的PCR仪各有两台)仪器设备充足具备PCR仪、Real-time PCR各一台,表1 各省级CDC PCR仪配置情况,2.各省级CDC常用试剂及耗材供应商情况,流感中心推荐使用的试剂和耗材常用试剂（Takara）Promega、Qiagen（常用）Roche、Sigma的试剂（发达省份）,表2各省级CDC常用试剂及耗材供应商情况,表3各省级CDC常用耗材供应商情况,3.个人防护设备,各省级CDC个人防护设备基本齐全个别省级CDC缺少个别防护设备如 有的CDC缺少N95口罩，有些省缺少面罩。,表4 各省级CDC个人防护设
8、备,4.检测标本的内容及检测方法的应用,辽宁、上海、山东、湖南4个省级CDC除了对人类标本样品进行流感病毒检测之外，还对动物来源的样品进行检测。通过对各省级CDC禽流感检测方法应用的调查可以反映出各省级CDC日常检测工作的内容。广西壮族自治区CDC日常工作的内容仅为快速流感检测，而河北、上海、浙江、河南、广东5个省级CDC除了调查表中提到的4个检测方法的应用外，还分别进行不同类别的检测，如爆发疫情的检测、人流感病毒亚型的鉴别、呼吸道病毒鉴别诊断、不明原因肺炎病例检测、环境标本检测。,表5 各省CDC检测标本内容和检测方法应用,5.实验室的管理,通过对生物安全工作、实验分区、标准操作规程以及实验
9、相关信息记录等4个方面考察各省CDC实验室管理的情况。,表6 各省CDC实验室管理情况,存在个别的问题,从这次问卷调查的结果看，各个省级CDC网络实验室的总体水平良好，但是仍有一些问题存在。,调 查 总 结,本次问卷的调查的目的在于对各省级CDC流感/禽流感检测网络实验室的仪器配置，试剂和耗材的使用、个人防护设备、检测工作内容及应用，以及实验室的管理等方面进行了解和促进。作为流感/禽流感检测的网络实验不仅需要良好的是实验仪器及防护设备的配置，来保证日常工作快速、安全的运转，同时也需要在实验室的管理上进行提高，从而使得检测结果的高标准和可重复性。,NIC 推荐one-step PCR引物更新,注：原推荐引物仍可使用,内参RNP（ribonuclease P：核糖核酸酶）序列,44,Realtime PCR 检测的内参,45,标本接收分装、核酸操作、PCR反应体系配制、电泳操作应当在不同房间进行。不同房间使用的防护服、移液器和枪头不应混用，标本分装和PCR反应体系配制的区域不应接触到核酸，并有单独的实验防护用品。一次实验过程中按从清洁区到核酸区的顺序进行，从污染区去清洁区应更换外防护服。怀疑有核酸污染的区域需要用水大量擦洗台面地面及仪器表面，保持通风。怀疑有核酸污染的试剂耗材不应继续使用。,46,核酸检测防污染几点建议,Thank You!,
