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1、1,基因结构与表达分析的基本策略,Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes,分子生物学系,2,2,分子生物学的三大核心技术,DNA序列分析DNA测序，1977,聚合酶链式反应DNA扩增，1985,DNA重组技术基因克隆，1973,3,一、DNA序列分析,二、核酸分子杂交,三、聚合酶链式反应,四、基因芯片和微阵列,五、Western免疫印迹,主要内容,4,（一）双脱氧末端终止法(Sanger,1977),一、DNA序列分析,（二）DNA自动化序列分析,（三）化学降解法(Gilbert,1977),5,Frederick San
2、ger1918,Walter Gilbert1932,The Nobel Prize in Chemistry 1980,Paul Berg1926,6,DNA测序技术基础：,高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。,7,(一）双脱氧末端终止法（dideoxy chain termination）,8,ATP、dATP和ddATP的结构,ATP,A,OH,OH,H,H,dATP,ddATP,NTP:核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP的合称；dNTP:脱氧核苷三磷酸d
3、ATP、dGTP、dCTP、dTTP；ddNTP:ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP；,9,掺入N个核苷酸,DNA合成反应模式图,10,DNA单链模板,引物,掺入ddNTP,延伸的新合成链,末端终止,11,1.双脱氧末端终止法原理,DNA合成反应中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5-磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP。,12,ddCTP,ddATP,ddTTP,ddGTP,dCTP,dATP,dTTP,dGTP,A G C T,5 T,4,7,11,G A A T G A 3,A,C,G,C,T,13,2.DNA测序主要步
4、骤,14,G反应管,T反应管,15,16,G A T C,17,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,单链DNA模板的制备,DNA模板与测序引物退火,掺入法标记反应,延伸-终止反应,放射自显影,阅读测序结果,测序步骤,18,（二）DNA测序自动化原理,采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。,19,ddCTP,ddATP,ddTTP,ddGTP,dCTP,dATP,dTTP,dGTP,20,21,表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型
5、,22,DNA自动测序步骤,4种不同荧光染料标记终止物ddNTPs,Sanger测序反应,反应产物同一泳道电泳分离,激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光,荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序,23,Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries,24,25,26,化学降解G反应模式图,Met,Met,Met,Met,27,最新测序技术,454技术(Roche)焦磷酸测序（Pyrosequencing）Solexa测序技术(Illumina)SOLiD技术(ABI)连接法测序,28,举例：Solexa测
6、序,HiSeq 2000,29,Solexa 测序：在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS sequencing by synthesis）。,完成人类基因组草图不同测序仪的比较图,30,二、核酸分子杂交,（Nucleic Acid Hybridization）,（一）Southern印迹杂交：检测DNA(Southern blot hybridization)Southern EM,1975,（二）Northern印迹杂交：检测RNA(Northern blot hybridization)Stark GR，1977,31,核酸分子杂交原理,标记的单链核酸探针与待检
7、测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链。,应用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。,32,33,33,印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”,译为印迹技术。,34,34,探针技术 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”。探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,35,Southern印迹杂交原理,将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行
8、杂交的过程。,（一）Southern印迹杂交,应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定 量分析。,36,1.制备基因组DNA2.用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3.琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段4.凝胶预处理（如强碱，DNA双链变为单链）5.Southern 印迹转移 6.标记核酸探针、探针与DNA片段杂交7.杂交结果显示,Southern印迹杂交基本过程,37,Southern印迹杂交示意图,38,将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。,39,40,地中海贫血的Southern blot 基因诊断,（1）仅一条染色体上的一
9、个基因缺失或缺陷，则链的合成部分受抑制，称为+地贫；（2）每条染色体上的2个基因均缺失或缺陷，称为0地贫；(3)1、2序列基本一致；基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。,1,2,+,+,0,+0,0 0,41,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,地中海贫血的直接基因诊断,42,/-/-/-/-正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,43,（二）Northern印迹杂交(Northern blot hybridization),指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。用于mRNA进行定性和定
10、量分析。,44,RNA琼脂糖凝胶电泳,Northern blot hybridization,应用举例,45,Northern blot 杂交分析mRNA的表达,靶 mRNA,3-磷酸甘油醛脱氢酶,46,46,三、其他杂交技术,1.斑点杂交(dot blot hybridization）,将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。,47,47,2.原位杂交（in situ hybridization）,用标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进行定性、定位和相对定量分析。,48,3核酸酶S1 保护分析法(nu
11、clease S1 protection assay）单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链则受到保护而不被降解。,49,4RNA酶保护分析法（RNase protection assay，RPA）,50,RPA基本程序：,待测RNA的分离体外转录标记RNA探针待测RNA与探针RNA进行液相杂交 RNA酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分离,51,三、聚合酶链式反应,(Polymerase Chain Reaction,PCR),（一）PCR技术原理,（二）耐热DNA聚合酶,（三）PCR引物及设计原则
12、,（四）PCR条件的优化,（五）PCR改进技术,（六）其它PCR技术,52,聚合酶链式反应(PCR):,（一）PCR技术原理,53,The replication of DNA,54,原理：PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。,55,1.PCR循环由三步组成：,变性（denaturation）,退火（annealing）,延伸（extension）,高温,合适温度,合适温度,56,57,58,2.PCR扩增终产物大小:,介于两条退火引物5末端之间的双链DNA片段。,循环一,59,循环二,
13、60,循环三,61,一对引物：正向和反向限制了PCR扩增的片段的范围,62,5CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAG
14、CAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG 3,GGTCCAGTACTACTACCCGT,AGAACATGGTGCGCAGGTT,3.引物设计实例,63,Y=A（1+E）n Y:扩增产物的量 A:最初靶DNA分子数 E:PCR扩增效率 n:循环次数,3.PCR产量,当E100,A=1时 Y=2n 2n(引物延伸产物的量）,64,（二）平台期与平台效应,1.平台效应（plateau effect）：PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台
15、效应。,影响因素：引物及dNTP底物浓度降低。酶与模板比例下降。,65,PCR平台效应,66,（二）耐热DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶（实现了PCR自动化）,从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。,95的半衰期:40 min 最适温度:72 80 催化反应速率:150300核苷酸/秒/酶分子,67,68,Taq DNA聚合酶特性：,53聚合酶活性；53外切酶活性；较弱的非模板依赖性；缺乏35外切酶活性。,69,PCR thermal cycler,70,PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析,500bp,400bp,200bp,300bp,1000bp,600bp
16、,700bp,800bp,900bp,Marker,PCR产物,71,无机离子及抑制剂的影响,Taq DNA聚合酶的活性对Mg 2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。,最适Mg 2+浓度：2 mmol/L K+浓度：50 mmol/L,72,几种高保真的耐热DNA聚合酶,1.Tth DNA聚合酶 2.Vent DNA聚合酶 3.Pfu DNA聚合酶,73,（三）PCR引物设计原则,引物的化学本质是什么？,单链寡核苷酸DNA或RNA片段。,DNA复制引物：单链RNA片段,PCR引物：单链DNA片段,74,PCR引物设计原则：1.引物与模板的序列要完全互补2.引物与引物之间避免形
17、成稳定的二聚体或发夹结构3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配),75,5CACTGAACGTAGGCCT3,3GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5,特异扩增,5CACTGAACGTAGGCCT3,3GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5,错误引发,1.引物与模板的序列要紧密互补,2.引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应(错配),76,引物之间应避免3端互补,3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,77,引物自身不应形成发夹结构,78,4.其它原则:,引物长度:1030 nt,碱基分布:A、T、G、C 随
18、机分布,G+C含量：40 60%Tm=4(G+C)+2(A+T),引物3末端碱基：最好选T、C、G，不选A,避免出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC,引物5末端碱基可不与模板DNA互补,79,1 A260 oligo DNA33gN:引物碱基数X：合成的oligo DNA A260单位Y：引物的pmol数,106 Y（pmol）=X33 330.N X=105 N,2.引物用量计算,80,模板引物Taq DNA聚合酶dNTPMg2+,退火,变性,延伸,PCR反应,81,（四）PCR条件的优化,1.Taq DNA聚合酶浓度：1.02.5 U/100 l反应液,2.dNTP浓度：20200 m
19、ol/L,3.Mg2+浓度：0.52.5 mmol/L,4.引物浓度：0.10.5 mol/L,82,（五）PCR改进技术,1.RT-PCR(reverse transcription PCR),以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。,83,RT-PCR原理,84,逆转录酶,AMV（avian myeloblastosis virus）酶活性最适温度42,MMLV（Moloney murine leukemia virus）：最适温度37,85,2.定量RT-PCR（QRT-PCR）,半定量RT-PCR,以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA，在不同引物对引导
20、下共同PCR扩增“看家”基因和目的基因cDNA。,86,选择内对照基因 组织中普遍表达、表达量比较恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和-actin mRNA等。,半定量标准 计算PCR 产物：靶cDNA/GAPDH cDNA,87,KPNA2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析,88,89,3.实时荧光定量RT-PCRReal-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR,PCR扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。,90,荧光染料,91,92,每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合
21、上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。,93,TaqMan Probe,一种水解式荧光标记探针。寡核苷酸探针的5端标记一个荧光报告基团（reporter），3端标记一个荧光淬灭基团（quencher）。,94,每产生一条DNA链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。,95,。,分子信标探针（Molecular Beacon Probe）,该探针具有发夹结构，5端标记荧光报告基团，3端标记淬灭基团。,96,探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发出荧光。,97,实时荧光定量PCR计算原理,PCR扩增效
22、率的差异使相同的样品最终产量有很大差异,98,99,CT或Tc或Ct值：,临界点循环（Threshold cycle），即从基线到指数增长的拐点所对应的循环数,100,101,传染病诊断、监测与疗效预后评估：揭示疾病发病机制,102,荧光定量 PCR仪 带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，配有电脑系统及分析软件。,103,（六）其它PCR技术,1.反向PCR（inverse PCR）原理,104,2.Alu-PCR,105,3.原位PCR(in-situ PCR)4.巢式PCR（nested PCR）5.不对称PCR（asymmetric PCR）,106,DNA Chip and Mi
23、croarray,四、基因芯片和微阵列,基因芯片上的阵列是由有规则排列的 cDNA或寡核苷酸等样本所组成的。,107,宏阵列(Macroarray),微阵列(Microarray),举例：HPV诊断芯片,108,DNA微阵列：寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）cDNA微阵列（cDNA microarray）在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子识别探针，能够平行分析大量基因转录表达，因此又被称为cDNA芯片。,109,110,C,B,A,Cy5-标记cDNA,Cy3-标记cDNA,C,B,A,C,B,A,C,B,A,C,B,A,C,B,A,C,B,A,样品1,样品2,Cy5/Cy3荧光标记,RNA提取,竞争性杂交显示基因表达量差异,111,DNA芯片技术的主要应用,基因组分析及发现新的基因基因表达的研究DNA序列分析基因诊断和基因药物设计,112,五、Western免疫印迹,Western blotting原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。,113,Western免疫印迹信号检测原理,114,蛋白质样品制备 SDS-PAGE分离 蛋白质转膜,Western blot程序,115,抗体与抗原杂交 信号检测分析,116,谢谢大家！,
