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1、试验一 外周血白细胞中DNA的提取与检测,1.掌握真核细胞中DNA制备原理。2.熟悉从外周血白细胞中提取DNA的方法。3.掌握紫外分析仪检测DNA的原理。,一、实验目的,二、实验原理,STMT破碎红细胞及白细胞的细胞膜离心收集白细胞核SDS破膜,苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤,琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪检测,三、仪器试剂,1、主要器具,Eppendorf离心管,电泳槽与电泳仪,紫外分析仪,台式离心机,微量移液器,2、主要试剂,STMT：（蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、TritonX-100）NE：（NaCl、EDTA Na2）TE：（Tris-HCl、EDTA Na2）SDS苯酚氯仿乙醇：无
2、水乙醇、70%乙醇,四、操作步骤,吸去血清，混匀含有EDTA Na2的抗凝全血取0.3mL至EP管（1）加1mLSTMT，混匀离心（12000rpm 1-2min），弃上清加1mL0.9%NaCl洗涤离心,弃上清（12000 rpm 1-2min）加460 L NE,充分吹散沉淀加35 L 10%SDS，轻轻混匀。,1、破碎细胞：,2、DNA提取：,加等体积苯酚，轻摇1min离心（12000rpm 3-5min）吸取上层水相于另一EP管（2）加1/2体积苯酚+1/2体积氯仿-异戊醇，轻摇1min 离心（12000rpm 1min）取上层水相于另一EP管（3）加等体积氯仿-异戊醇离心（12000
3、rpm 1min）取上层水相于另一EP管（4）,3、沉淀DNA,加1/10体积3M NaAC，混匀加1mL无水冰乙醇置-20冰箱，0.5-1h 离心（12000rpm 5min）弃上清加70%冷乙醇1mL洗涤离心（12000rpm 5min）弃上清自然干燥加50 L TE溶解，室温1h。,4、电泳,制胶：0.8%的琼脂糖凝胶（琼脂糖0.32g+TBE40ml，混合，加热熔化，冷至60，加EB20 L,制胶）,加样：DNA样品10 L+载样缓冲液2 L，混匀，取10 L点样,电泳：点样端接负极，100V，40min,紫外分析仪下观察结果,电泳结果图,五、注意事项,1、注意安全（苯酚具有强腐蚀性），操作戴手套；2、所用玻璃器皿及溶液需经高压灭菌处理；3、混匀试剂、吸取上清等操作时应动作要轻柔,避免动作剧烈；4、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时 注意不要吸取到中间层及有机相；5、沉淀后注意不要将DNA沉淀倒掉。,谢谢各位,
