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1、选修1 生物技术实践,专题2 微生物的培养与应用,基础梳理,基础梳理,1.微生物的营养(1)碳源碳源是为微生物生长提供所需要的_元素的物质，_型微生物的碳源主要是有机碳。_型微生物利用CO2或碳酸盐作为碳源。(2)氮源：氮源是提供微生物生命活动所需要的_元素的物质。(3)水：水是微生物生命活动必需的一种重要物质。,碳,异养,自养,氮,(4)无机盐无机盐对微生物的生理功能有：构成微生物细胞的组成成分；作为酶的组成成分，也是某些酶的激活剂；调节和维持微生物细胞的渗透压和pH；某些无机盐具有特殊功能，如化能自养细菌的能源物质NH4+等。(5)生长因子。(6)培养微生物还需要满足微生物生长对pH、特殊
2、营养物质以及氧气的要求。,2.培养基(1)培养基的概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供适合其_的营养基质。(2)配制原则目的要明确；营养要协调；pH要适宜；要经济节约。(3)培养基的类型按照培养基的物理性质可以分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。按照培养基的化学成分可以分为合成培养基（用化学成分已知的化学物质配制而成的，用于分类鉴定）和天然培养基（用天然物质配制而成，用于工业生产）。按照培养基的用途可以分为选择培养基和鉴别培养基等。,生长繁殖,营养物质,3.无菌技术(1)无菌技术的主要内容对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基
3、等器具进行灭菌为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。(2)实验室常用的消毒方法_消毒；_消毒；_消毒。,煮沸,化学药物,紫外线,(3)实验室常用的灭菌方法灼烧灭菌：将微生物的_，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在_灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，_或_等容易被污染的部位，也可以通过_来灭菌；干热灭菌：能耐高温的，需要保持_的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌；高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的_内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为1
4、21 的条件下，维持1530 min。,接种工具,酒精灯火焰的充分燃烧层,试管口,瓶口,火焰灼烧,干燥,高压蒸汽灭菌锅,4.微生物实验室培养的实验操作(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基其基本过程为_、_、_、_、_五个步骤。(2)纯化大肠杆菌原理：在培养基上将细菌稀释或分散成_细胞，使其长成_的菌落，这个_菌落就是一个纯化的细菌菌落。,计算,称量,溶化,灭菌,倒平板,单个,单个,单个,微生物常见的接种的方法平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成_，接种，划线，在_里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成_菌落。稀释涂布平板法：将待分离的菌液经
5、过大量_后，均匀_在培养皿表面，经培养后可形成_菌落。,单个,平板,恒温箱,单个,稀释,涂布,归纳整合,一、培养基不同的微生物需要采用不同的培养基配方，尽管培养基的配方各不相同，但是其基本成分都包括水、碳源、氮源和无机盐。1.培养基的配制原则(1)目的要明确:目的包含两层含义：一指培养的微生物种类；二指培养的目的，是用于生产还是科学研究，因为二者对培养基的化学成分、物理状态等方面要求不同，例如用于生产的培养基应具有原料易得、价格低廉、配制方便等特点，而用于科学研究的培养基应具有成分含量准确，可多次重复实验的特点。,2.培养基配制的程序及注意事项(1)培养基配制的程序计算称量溶化 调pH 灭菌
6、倒平板(2)培养基配制时的注意事项全程要求无菌操作，无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效地避免操作者自身被微生物感染。培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，当感觉到锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板。操作时应使锥形瓶的瓶口通过火焰，以防止瓶口的微生物污染培养基。,平板冷凝后皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，若将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。在倒平板的过程中，不能将培养基溅到皿盖与皿底之间的部位，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底
7、之间的培养基上滋生。,3.培养基的种类按培养基物理性质划分:,按培养基的化学成分划分：,按培养基的功能分：,二、微生物的纯化培养（两种接种方法）1.平板划线法：操作简单，但单菌落不易分离(1)无菌操作：在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避
8、免细菌污染环境和感染操作者。,(2)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。(3)由于划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，所以，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布平板法：操作复杂，但单菌落易分离(1)无菌操作：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，对涂布器等接种器具进行消毒和灭菌、酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围。(2)每一个稀释度下涂布三个平板作为重复组，不同稀释度下涂布的平板形成对
9、照组，且每个平板所用的样液不超过0.1毫升。(3)统计实验结果时注意选取菌落数介于30300个之间的平板进行计数，且重复组结果要有相近性。,3.评价和分析实验结果(1)培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。(2)接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合该菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。(3)是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的菌落的大小会有明显的不同，及时观察记录
10、的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。,三、微生物营养1.碳源,关于自养微生物和异养微生物碳源的利用和能量的来源：自养微生物以CO2或碳酸盐作为唯一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物为碳源进行代谢生长。异养微生物的生命活动所需的能源主要是依靠物质氧化分解放能获得的，碳源是异养微生物的主要能源物质；某些异养微生物也可以光能作为能源，例如红螺菌，它不能以CO2作为主要或唯一碳源，而需要有机物的参与，才能利用光能将CO2还原成细胞物质，这种营养类型称为光能异养型。总结如下表：,三、微生物营养1.碳源,不同的微生物所需要的碳源不同,利用某些微生物碳源的特殊性解决环境污染、粮食危机等问
11、题。A.利用某些细菌、放线菌、酵母菌以石油作为碳源的原理，消除石油污染。B.运用某些细菌可以分解、利用氰化物、酚等有毒物质的原理处理有害物质。C.研究开发以纤维素、石油、CO2、H2等作为碳源和能源的工业微生物，解决工业发酵用粮与人们日常用粮的矛盾。,2.氮源,关于氮源物质的来源和作用：对许多微生物来说，既可利用无机含氮化合物作为氮源，也可利用有机含氮化合物作为氮源。固氮微生物可以利用氮气作为氮源。铵盐、硝酸盐等既可作为微生物最常用的氮源，也可作为某些化能自养微生物的能源物质。自养微生物与异养微生物类型的划分主要是依靠能否以CO2作为生长的主要或唯一的碳源，而不是由氮源决定。,跟踪训练,（20
12、09 年重庆卷）下列有关大肠杆菌的叙述，正确的是（）A.大肠杆菌以复制方式进行繁殖，其拟核是一个环状DNA分子B.在含葡萄糖和乳糖的培养基上，大肠杆菌首先利用乳糖作碳源C.用大肠杆菌工程菌生产干扰素时，应及时添加核酸等生长因子D.处于对数期的大肠杆菌，常作为生产用的菌种和科研的材料,解析：大肠杆菌以二分裂的方式进行繁殖；大肠杆菌存在着分解葡萄糖的组成酶和分解乳糖的诱导酶，分解葡萄糖的组成酶一直存在，只有当葡萄糖分解完后，乳糖才能诱导产生分解乳糖的诱导酶，所以在含葡萄糖和乳糖的培养基上，大肠杆菌首先利用葡萄糖作碳源；大肠杆菌的生长不需要生长因子；处于对数期的大肠杆菌，其生长繁殖活跃，代谢稳定，常
13、作为生产作用的菌种和科研的材料。答案：D,基础梳理,1纤维素是_类物质，_是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。2纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即_、_和_，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成_。正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。,多糖,棉花,C1酶,CX酶,葡萄糖苷酶,葡萄糖,3筛选纤维素分解菌可以用_法，这种方法能够通过_直接对微生物进行筛选。4刚果红是一种_，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种
14、反应。5分离分解纤维素的微生物的实验流程图如下：_梯度稀释_。,挑选产生透明圈的菌落,刚果红染色,颜色反应,染料,土壤取样,选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,归纳整合,土壤中纤维素分解菌的分离实验的具体操作步骤,1.土样采集土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。2.选择培养选择培养需要的仪器有：250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和1
15、0 mL的移液管、天平、摇床、温度计等。,培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121 下高压蒸汽灭菌20 min。选择培养的操作：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 下振荡培养12 d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。,3.刚果红染色法分离纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1 mL移液
16、管、装有9 mL无菌水的20 mL大试管、温箱等。培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基，在121 下高压蒸汽灭菌20 min。倒平板操作：将灭菌后的固体培养基溶化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入1520 mL培养基，凝固后待用。制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至106。,涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30 倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。,跟踪训练,配制的培养基成分是：纤维素粉
17、、NaNO3、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、KCl、酵母膏、水解酪素，该培养基能使下面哪种微生物大量繁殖（）A酵母菌 B自生固氮菌C各种细菌 D纤维素分解菌,解析：该培养基内含有纤维素粉，故能够分解纤维素的菌类才能大量繁殖，故答案为D。答案：D,热点聚焦,（2009 年上海卷）氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下图所示实验方案筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如表1。,表1培养基的组成,(1)配制号固体培养基时，除添加号液体培养基成分外，还应添加1的_。(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是_。(3)从用途上来说，号培养基和
18、号培养基分别属于_培养基和_培养基。在号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是_。(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为_。(5)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的号培养液中培养，得到生长曲线如下图所示。从图中可知，SP1菌在_培养条件下最早停止生长，其原因是_。,解析：第(1)问中还应添加1%的琼脂；培养基配制时，应先调pH，后灭菌；选择培养基是在培养基中加入某些生物因子或化学物质,对培养的细胞具有选择性,适应者存活,不适者死亡，从而达到选择的目的。号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用培养基，号培养基是为选择出SP1菌株，属于选择培养基，号培养基成分
19、中所含的N物质为硝酸铵，它为SP1菌株提供氮源；在恶劣环境下，一些菌体会形成芽孢休眠体来度过不良环境；SP1菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽，菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。,答案:（1）琼脂（2）先调pH，后灭菌（3）通用 选择硝酸铵（4）芽孢（5）20 mg/L氯苯氯苯最早耗尽,名师点睛：(1)微生物培养的基本技术包括培养基的配制、灭菌、接种和培养等。(2)培养基是用人工方法按照微生物的需要配制而成的一种营养基质。配制培养基时，不仅要考虑满足不同微生物的不同营养需求，还应考虑适宜的pH及渗透压等。(3)在微生物的实验、生产和科学研究中，需要对所有器材、
20、培养基进行严格灭菌，不能被任何外来的杂菌污染。高压蒸汽灭菌法是微生物学研究和教学中运用最广泛、效果最好的灭菌方法。(4)接种时必须进行严格的无菌操作，接种要在无菌室中进行，接种工具要严格灭菌，培养一般在培养箱中进行。,热点训练,2008年 9月8日，江西省农科院下属的南方航天育种技术研究中心接到中国空间技术研究院的紧急通知，南方航天育种技术研究中心此次将搭载“神七”遨游太空的物种是微生物菌种和杂交水稻两类，共8种。其中，微生物菌种包括灵芝、平菇、虫草、双孢蘑菇、杏鲍菇、茶树菇6种，杂交水稻包括“洲A”和“洲B”两种。假设你接到南方航天育种技术研究中心的“培育平菇”课题，请回答以下问题：（1）为
21、什么这次“神七”遨游太空的物种会选择微生物菌种？_。（2）下列哪些原料不适宜作为平菇的培养基，为什么？A.棉子壳 B.碎木屑 C.稻草 D.牛肉膏胨_,(3)在接种前，为避免杂菌感染，必须经过_过程，其原理是_。（4）请设计“培育平菇”的操作程序。_,答案:(1)微生物是低等生物，遗传背景比较简单，而且微生物的自然资源缺乏，因此，容易产生突变，一旦突变就会形成新的东西，这对航天育种研究有非常大的价值(2)D。牛肉膏蛋白胨培养基一般用于培养细菌。平菇是腐生真菌，常用的培养基是棉子壳、碎木屑、稻草等(3)灭菌 高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动(4)配制棉子壳培养基，高压蒸气灭菌，接种
22、，培养，每日做观察记录并分析。,走进实验室,基础再现,一、关于选择培养基1.概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。2.举例：以纤维素作唯一碳源的选择培养基，可以分离到分解纤维素的微生物；缺氮培养基可以分离到固氮微生物等。3.分解尿素的细菌的培养基即为选择培养基，培养基的氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。,实验课题：微生物的选择培养和鉴别培养,二、菌落数目的统计1.显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。缺点：不能区分死菌与活菌。2.间接计数法（活
23、菌计数法）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少个活菌。统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示。因为菌落数往往比活菌的实际数目低。,三、纤维素分解菌的筛选原理1.刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。2.纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。四、土壤中纤维素分解菌的筛选1.方案：土壤取样 选择培养梯度稀释 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 挑选产生透明圈的菌落。2.选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到
24、所需要的微生物。3.涉及到的微生物技术主要是：培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用和土壤取样等。,过程设计,1.筛选菌株微生物的选择培养，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术。在本专题课题2提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。,2.统计菌落数目统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落
25、，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。教材的实例是为了说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示了学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的
26、重复组的结果是否一致，若结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,3.设置对照教材的实例是为了说明设置对照组的重要性。A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因呢？这可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,易错归纳,1
27、.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。2.样品的稀释操作是否成功如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。3.重复组的结果是否一致如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要分析产生差异的原因。,精题演习,1.（2009 年安徽卷）下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（）A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.
28、取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数,解析：本题考查的是微生物的应用与培养的有关知识。确定对照组无菌后，选择菌落数在30300的实验组平板进行计数，求出平均值，再通过计算得出土壤中细菌总数。答案：D,2.下面是某同学做自生固氮菌分离实验的方案和观察结果：(注：自生固氮菌能以空气中的氮气为氮源),答案：1.培养基中含有NaNO3不含氮的钠盐2.接种中使用蒸馏水 无菌水3.接种中将培养皿盖放在桌面上 略微打开培养皿盖4.接种中未填写实验内
29、容、接种人的姓名和接种日期 并在顶盖上写明实验内容、接种人的姓名和接种日期(在接种步骤后面加上),课时作业,1有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需的营养物质有较大的差别，故要针对微生物的具体情况进行分析。对于A、B选项，它们的表达是不完整的。有的碳源只能作为碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时作为氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时可作为能源，如葡萄糖；有的碳源既作为氮源，也作为能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D,2.下列关于微生物生长繁殖的营养物质的说法，错误的是A.微生物的营养物质包括碳源、氮源、生长因子、无机盐等等B.糖类（尤其是葡萄糖）是主要碳源C.生长因子是微生物生长不可缺少的微量无机物D.对于异养微生物，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源,解析：生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，而不是无机物。答案：C,祝,您,学业有成,
