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1、前言,保证产品无菌是注射剂产品质量保证的核心问题。在业界，常用“无菌保证水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念来评价灭菌（无菌）工艺的效果，SAL的定义为产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。为了保证注射剂的无菌安全性，国际上一致规定，采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。微生物挑战试验（灭菌效力验证）是无菌药品生产工艺验证的重要环节，目的是证明灭菌后微生物的残存概率不大于10-6。,法规要求,CHP2010附录灭菌法中涉及生物指示剂的相关要求制备生物指示剂用微生物的基本要求：(1)菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有
2、可能污染菌的耐受性。(2)菌种应无致病性。(3)菌株应稳定。存活期长，易于保存。(4)易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90以上。,法规要求,根据新版GMP征求意见稿内对生物指示剂的说明“应按供应商的要求保存和使用生物指示剂，并通过阳性对照和D值测试来确认其质量”。,法规要求,化学药品注射剂和多组分生化药注射剂基本技术要求中提到“微生物挑战试验所用生物指示剂的耐热性及数量应对灭菌工艺构成必要的挑战，生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的耐热性。采用过度杀灭法（F012）灭菌工艺的，可不进行微生物挑战试验。”,法规要求,CHP2010附录灭菌法中涉及生物指示剂的相关要求生
3、物指示剂的应用：在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的D 值，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。,推荐使用的生物指示剂,03版验证指南中列出的湿热灭菌工艺中常用的生物指示剂,CHP2010版中列出的湿热灭菌工艺中常用的生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(如NCTC 10 007、NCIMB8157、ATCC7953)。D 值为1.53.0min，每片(或每瓶)活孢子数51055106 个，在121、19min 下应被完全杀灭。此外，还可使用生孢梭菌孢子（如NCTC 8594、NCIMB 8053
4、、ATCC 7955)，D 值为0.40.8min。,生物指示剂菌种的选择,08年年度回顾，车间洁净区最耐热菌株D100值为14.2，09年年度回顾，车间洁净区最耐热菌株D100值为16.7。连续两年，车间洁净区最耐热菌株D100值最高为16.7，换算成D121约为0.12。因此，我们应该选择D121值比0.12大的菌株。由于菌株的D值受介质影响，因此，我们需要测定在各介质中的实际的D值，确保生物指示剂适合我们公司使用。,生物指示剂菌液浓度的计算（阴性分数法）,假设F0=8，用D121=0.7的枯草芽孢杆菌计算：SLRbi=F0/Dbi=11.43（SLR为孢子对数下降值）SLRbi=lgN0
5、-lgN（N0和N分别为灭菌前后孢子数）根据阴性分数法，N=2.303lg(n/q)，其中n为挑战性试验样品总数，q为试验结果呈阴性的瓶数。如试验结果20瓶挑战瓶均呈阴性，在计算时可假设只有19只瓶呈阴性（因为q=n，lg(n/q)=0，代入公式SLRbi=lgN0-lgN时，数学式无意义），则可得出：N=2.303lg(n/q)=0.0513lgN=-1.29lgN0=SLRbi+lgN=11.43-1.29=10.14N0=1010.14=1.41010(cfu/瓶),生物指示剂菌液浓度的计算（残存曲线法）,假设F0=8，用D121=0.7的枯草芽孢杆菌计算：F0/Dbi=lgN0+1=1
6、1.43lgN0=10.43N0=1010.43=2.71010(cfu/瓶),生物指示剂菌液浓度的计算,通过以上2种方法计算得出，用孢子浓度为的1010(cfu/瓶)D121=0.7的枯草芽孢杆菌的样品来验证，灭菌后样品为无菌，说明灭菌条件达到F0值大于等于8。,无菌保证水平计算,SLRS=SLRbi Dbi/DS=66.68（SLRbi为生物指示剂孢子对数下降值，SLRS为灭菌前产品中污染微生物对数下降值）SLRS=lgN0-lgN 车间中控微生物标准为10cfu/瓶，因此假设N0为10。lgN=lgN0-SLRS=1-66.68=-65.68N=10-65.68，无菌保证度为10-65.68，远大于要求的10-6,生物指示剂菌液浓度的计算,若选用D值更高的嗜热脂肪芽孢杆菌计算：(D121=1.6)阴性分数法：lgN0=SLRbi+lgN=F0/Dbi-1.29=8/1.6-1.29=3.17N0=103.17=1.5103(cfu/瓶)残存曲线法：F0/Dbi=lgN0+1=5lgN0=4N0=104(cfu/瓶)无菌保证水平计算：SLRS=SLRbi Dbi/DS=66.66lgN=lgN0-SLRS=1-66.66=-65.66N=10-65.68，无菌保证度为10-65.68，远大于要求的10-6,生物指示剂选择,
