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1、型糖尿病自身抗体检测,糖尿病的分型诊断的进展,1979年WHO提出了原发性临床糖尿病分为胰岛素依赖型和非胰岛素依赖型，依赖型与非依赖型的区别主要依据胰岛素细胞功能受损的程度，临床上是否依赖胰岛素而言，并不反映其发病本质1997年WHO建议取消依赖型与非依赖型，改为1、2型。1、2型的区别要看病因是否由胰岛细胞自身免疫破坏造成，1型与2型是完全不同的两类疾病，但2型非依赖型可发展成1型胰岛素依赖型，成人缓慢进展型就经历了这个过程。,WHO（1997年）建议的糖尿病分型方案,1型糖尿病（T1DM）胰岛细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏：A.免疫型；B.特发型2型糖尿病（T2DM）胰岛素抵抗为主体的胰岛素相
2、对缺乏，或胰岛素分泌受损为主体的胰岛素抵抗其他特殊类型糖尿病妊娠期糖尿病,1型糖尿病的流行病学,主要见于15岁以前的儿童和未成年人；亚洲及我国发病率相对较低（我国儿童中的发病率为0.59/10万每年，全国T1DM的总数至少200-400万）各国的1型糖尿病较以前有逐年增加趋势；不少地区的1型糖尿病的发病率与季节有关,1型糖尿病的发病机制,遗传易感性 环境因素 感染、饮食、地理、气候 细胞自身免疫损伤 细胞破坏、功能损害 胰岛素分泌缺乏,1型糖尿病的病程,细胞量,1型糖尿病的病程,遗传易感性,环境因素胰岛素正常自身抗体阳性血糖正常,胰岛素血糖正常应激血糖,胰岛素血糖,80%细胞破坏胰岛素缺乏临床
3、糖尿病,1型糖尿病和2型糖尿病的比较,1型糖尿病和2型糖尿病的区分,一般30岁，起病急，中到重度症状明显体重下降，消瘦，尿酮或DKA空腹或餐后C肽低下免疫标记物(GADA,ICA,IA-2)是 否 T1DM T2DM,免疫介导型1型糖尿病亚型的特征,抗胰岛细胞抗体(ICA),1974年Bottazzo采用间接免疫荧光法在胰岛素依赖性糖尿病患者血清中首次检测到抗胰岛细胞抗体（islet cell autoantibodies,ICA）。ICA是针对胰岛细胞内多种抗原的一组抗体,其靶抗原至今尚未完全阐明。,与糖尿病相关的自身抗原不仅在细胞表达，这些抗原的组织分布可分为：(1)细胞特异的，如胰岛素；
4、(2)胰岛细胞特异的；(3)神经内分泌特异的，如分子量为65 kD的谷氨酸脱羧酶（GAD65kD）、ICA512、神经节苷脂（ganglioside）、脑硫脂（sulfatides）等；(4)较广泛的分布，如HSP62等。目前所知的ICA主要抗原的是谷氨酸脱羧酶（GAD）和酪氨酸磷酸酶（IA2）,检测方法：间接免疫荧光法 组织化学染色法 免疫沉淀化学法 ELISA法,目前ICA的检测方法主要是以猴胰腺为基质的间接免疫荧光法，但易受组织的固定方法的影响。抗胰岛细胞抗体与胰腺的内分泌部位反应，可见所有胰岛细胞胞浆呈现均质到颗粒型荧光。,检测方法的标化：1983年瑞典的Ludvigsson为一名1型
5、糖尿病新发病者做了血浆置换,这份血浆在青少年糖尿病基金会(FDA)组织的ICAs定标实验中,在参加这项工作的所有实验室检测时均为ICAs阳性,于是用这份血样定出了ICAs的JDF单位,并逐渐成为国际上较为通用的单位。,敏感度81%(44%100%)，特异度96%(64%100%)特异度较GADA和IA2A差 ICA可作为早期预测指标能早于T1DM发病8年前被检测出高滴度的ICA（大于20-40JDF单位）预示疾病进展的高危险性。大部分T1DM病人的ICAs在发病2年后消失，ICA持续阳性超过23年者，仅占T1DM的10%。ICA滴度的持续高水平通常与细胞的损伤有关，ICA的水平与C肽水平呈负相
6、关。ICA和其他胰岛自身抗体（如GAD或IAA）同时阳性对疾病更有诊断价值，这类病人发生T1DM的危险性是仅ICA阳性的病人的3-5倍。,ICA在不同人群中的阳性率,ICA的检测对1型糖尿病有很好的预测价值,谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab),谷氨酸脱羧酶氨基丁酸（GABA）的合成酶表达于人脑及胰岛中均有，主要位于细胞浆中具有抑制生长抑素和胰高糖素分泌的作用，并可调节胰岛素的分泌和胰岛素原的合成,1990年，Beakkeskov首次证明GAD是1型糖尿病的自身抗原GAD分子存在65kD和67kD两种形式，两者在氨基酸水平上有65%的同源性和80%的相似性，免疫源性也基本相同，目前认为T1DM中抗
7、GAD65抗体更常见,检测方法：免疫沉淀酶活性法 放射免疫法 ELISA法 间接免疫荧光法 化学发光法,最常用的GAD-Ab的检测方法是ELISA法和放免法。放免法由于存在放射性污染目前已逐渐被ELISA法替代ELISA法采用亲和素和生物素扩大级联反应增强了检测的敏感性,GAD检测方法的评价,GAD 自身抗体:41 个实验室测定了血清GADab,其中多数运用重组人GAD 的RIA法,其调整敏感性是091%(平均81%)。ELISA 法与RIAs 法比较,有较好效果,其调整敏感性77%,双管测定的阳性或阴性一致性为100%。在125例血清RIA法的阳性率为22.4%，ELISA的阳性率为26.4
8、%，两者的显著相关（P=0.025)。均 与ICA显著相关P值分别为0和0.01。说明ELISA法可以替代RIA法做为1型糖尿病自身抗体筛选的有效手段。（RIA试剂欧蒙公司；ELISA试剂美国BLOMERICA 公司）,GAD在T1DM发病机理中的作用,分子模拟(molecular mimicry)机制致病学说：病毒蛋白如柯萨奇B 病毒p2C 蛋白肽段,胰岛细胞抗原分子谷氨酸脱羧酶(GAD)的部分肽段序列相似,前者(外源性蛋白多肽)在诱导机体产生免疫的同时,亦可能诱发针对自身胰岛细胞的攻击，导致细胞的损伤。,GAD-Ab具有与细胞缓慢损伤相关性好、出现早、持续时间长、年龄跨度大、阳性率高、检测
9、易标准化等特点，是目前公认的诊断LADA及预测胰岛功能的免疫学指标GAD-Ab可于发病前10年测出，且在此期间呈高低度持续存在，约80%新发患者血清中GAD阳性且水平较稳定，病程10年以上仍存在高滴度GAD抗体。,GAD的临床应用,GAD抗体在大多数T1DM患者中阳性，且阳性率不随病程延长而下降。实验显示新诊断的患儿中GAD抗体阳性率为74%，长病程者为67%，而他们的ICA阳性率分别为64%和14%。如在初发T1DM患者中查到GAD抗体有助于排除T2DM，以助于DM诊断分型并指导治疗。在T1DM一级亲属（高危人群），33.3%的GADA阳性者可能患TIDM。TIDM一级亲属中GAD抗体阳性率
10、为15%左右，其中1/3在618个月后发展为T1DM。GADA在僵人综合征（SMS）中的阳性率为100%,此外还见于与T1DM相关的多腺体自身免疫综合征。,GAD在不同人群中的阳性率,抗酪氨酸磷酸酶抗体(ICA 512/IA 2ab),ICA 512/IA 2是利用1型糖尿病患者或其前期病人的血清免疫筛选胰岛细胞的cDNA文库得到的一个新的细胞自身抗原。其氨基酸序列与T淋巴细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)CD45相似，而碱基序列与人胰岛素瘤克隆的 cDNA(IA2)相近。Northern印迹示ICA 512/IA 2在胰岛、脑和垂体中均有表达。Rabin等发现ICA512实际上是ICA的一个片段
11、。,IA2A存在于大约65%（55%-75%）的新发T1DM病人中，而正常对照人群中阳性率小于1%。IA-2Ab 特异性强,在不伴1型DM的自身免疫病患者中较少发现。T1DM患者中IA2A阳性率可能受多种因素影响，15岁以上T1DM者IA2A阳性率最高，随增龄阳性率逐渐下降，但其发生率与DGA抗体无关。携带IA-2抗体的个体在5岁时患型糖尿病的风险是34岁时的11倍。,检测方法 酶联免疫吸附分析法(ELISA)放射配体分析法(RLA)35S标记的放射免疫沉淀法,抗胰岛素自身抗体(IAA),IAA的识别的抗原表位是胰岛素A链的A8-A13残基和B链的B1-B3残基IAA与逆转录病毒的p73蛋白间
12、存在交叉反应，提示内源性的逆转录病毒感染与T1DM的发生有关IAA与胰岛素治疗诱导的抗胰岛素抗体相似,IAA在新诊断的T1DM患者中的阳性率为40%，多见于儿童（4岁），在成人中的阳性率仅为4%，在5岁以前发生的IAA阳性率达50%，IAA滴度随增龄而降IAA与ICA相关，在高危人群中约40%ICA阳性者IAA阳性。IAA水平与T1DM发生的速度呈相关性，高滴度IAA者发病较快,检测方法 放免法；ELISA法不同实验室及不同方法测定IAAs,结果的一致性显著低于IA2A和GADAs。,自身抗体对T1DM的诊断 敏感性和特异性,T1DM患者中胰岛自身抗体的阳性率常因种族、发病年龄、病程和临床亚型
13、不同而不同。单一的自身抗体的检测缺乏最佳的敏感性和特异性，目前常采用多项自身抗体的联合检测，对T1DM的诊断准确性更高IA2Ab 联合GADAb 及IAA 两种以上抗体阳性具有68%的阳性预测价值,80%敏感性和100%特异性。,预测率最高的组合是ICA加IA-2A和（或）IA-2抗体。另一项研究发现采用两步筛查法，即先筛查IA-2A和（或）GAD抗体，然后筛查IAA和（或）ICA，对糖尿病的预测敏感度最高。另有人认为ICA的检测缺乏稳定性，通常所用的间接免疫荧光法仅能做到半定量，而推荐使用IA22Ab 联合GAD2Ab 及IAA的筛选组合。近来,国外还建立了一种GAD-Ab 和IA2-Ab
14、一步性联合检测法。其结果与GAD-Ab、IA2-Ab 分别检测结果高度一致。此法简单高效、成本低、重复性好,并可用毛细血管血作为标本,适于在一般人群特别是少儿中进行普查。,胰岛细胞自身抗体的组合预测型糖尿病,跟踪的年数,糖尿病的发病率,Progression to Diabetes vs Number of Autoantibodies(GAD,ICA512,Insulin),Percent not Diabetic,Years of Follow-up,3 Ab n=41 17 8 1 2 Abs n=44 27 15 4 2 11 Abs n=93 23 14 10 6 4,Verge e
15、t al.Diabetes,1996;45;926,Gestational Diabetes:Risk at 2 years Type 1 Diabetes by AutoantibodiesICA,GAD65,ICA512(IA-2),Sensitivity GAD=63%;Sensitivity 3 Abs=82%Ziegler et al.Diabetes 1997:46:1459-67,N=437,Progression,InsulinGADIA-2,A.Ziegler,First antibody is insulin/proinsulin,10,8,6,4,2,0,8,6,4,2,0,IAA,10,8,6,4,2,0,8,6,4,2,0,Age(years),Cumulative frequency(%),A.Ziegler,
