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1、第四节免疫金（银）组织化学技术,免疫胶体金标记的原理,胶体金是氯金酸（HauCl4）在还原剂如白磷、维生素C、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金颗粒标记蛋白质（抗原、抗体或酶）的原理是金颗粒表面负电荷与蛋白质正电荷之间非共价键的静电引力相互吸引，当达到范登华引力半径范围之内时，蛋白质与金颗粒表面形成牢固结合。胶体金颗粒表面较粗糙。亦有利于蛋白质吸附。由于结合过程主要是物理吸附作用，因此并不影响蛋白质的生物活性和免疫活性。,1、原理免疫金（银）组化染色技术是金颗粒标记的抗原（抗体）与相应的抗体（抗原）特异性结合后，在银显色剂
2、的作用下，标记物上的金颗粒起液化作用，使显影液中的硝酸银离子还原成银原子沉淀，在抗原抗体复合物的金颗粒周围形成一个逐步增大的黑色“银壳”，由于金颗粒的液化作用，更多的银离子被还原，最后使抗原位置放大，从而提高镜下的可见度。2、操作步骤 3、方法评价,免疫金（银）组织化学染色法,第十三章免疫细胞分离及检测技术,第一节 免疫细胞的分离进行有关细胞免疫方面的检测，特别是有关免疫细胞功能的体外实验，往往须将待检淋巴细胞从血液或组织中分离出来，而外周血会有多种细胞成分，包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。,外周血单个核细胞（periphetal blood mononuclear cell
3、s，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核粒细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.0751.090，血小板为1.0301.035。因此利用一种介于1.0751.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心。使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。为使沉浮速度加快，一般要作离心分离，,免疫金（银）组织化学染色法,从上可以看出，分离溶液是分离各类细胞的关键，对分离溶液的基本要求是：对细胞无毒；基本等渗；不溶于血浆等分离物质；有一定的比重。聚蔗糖泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，商品名为
4、ficoll，分离人外用血淋巴细胞以密度为 1.0770.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.0761.090之间。常规的单个核细胞分离液由 2份6聚蔗糖蒸馏水溶液1份34泛影葡胺生理盐水溶液组成，其比重为1.077 0.002。,Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图131）。本法分离的单个核细胞纯
5、度可达95，淋巴细胞约占9095，细胞收率可达80以上，但室温超过25时可影响细胞收率。,（一）贴壁粘附法利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶中，至37温箱静置lh，单核细胞和粒细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。如继而用橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞群。但因B细胞也有贴壁现象，采用本法分离到的淋巴细胞群中B细胞会有所损失。可调整静置时间控制细胞的收率和纯度。,淋巴细胞的分离,（二）吸附柱过滤法同样利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶 Sephadex G10的层析柱中，凡有粘附
6、能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。已知有关细胞的粘附能力为：巨噬细胞或单核细胞树突细胞B细胞T细胞红细胞。可以通过控制柱体和洗脱条件获得有关细胞。此法对细胞的损害较小。,（三）磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3m的羰基铁颗粒，置37温箱内，不时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬铁颗粒后，将磁铁置于管底，单核细胞将被吸引，上层液中即为较纯的淋巴细胞。（四）Percoll分离液法Percoll分离液法是一种连续密度梯度离心分离法。,（一）E花环沉降法此法的基本原理是利用T细胞有羊红细胞受体（E受体），可以与羊红细胞结合形成较大的E
7、花环的特性，可将T细胞和B细胞分离。将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继而用淋巴细胞分层液分离，浮悬在分层界面的细胞群则富含B细胞，而T细胞由于与羊红细胞结合形成E花环后比重较大，则沉降在管底。（二）尼龙毛柱分离法尼龙毛（nylon wool）即聚酰胺纤维。该法是利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，将T和B细胞分离。,T细胞和B细胞的分离,1、分离细胞的保存 在通常的情况下，分离所得的细胞需要加以适当的保护，否则活力将迅速下降，甚至死亡。2、细胞活力测定 细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的大小对以后的试验结果有很大的影响。,不同细胞分离方法的综合评价,分离细胞的保存及活力测定,
