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1、植物细胞胞吞作用和内膜系统 的荧光显微观察,植物细胞的吞排作用,细胞伸长生长所需要的物质分别在内质网(如蛋白质、脂类)和高尔基体(细胞壁的一些组分，如果胶、半纤维素)合成，运输小泡胞吐作用分泌至胞外或质膜上，促进新的细胞膜和细胞壁的生长另一方面，在细胞扩展增长过程中一些过剩的蛋白质、多糖、细胞壁前体物质等细胞成分，需要通过胞吞作用重新回到胞质中使之得以及时回收，循环利用，即细胞的内吞和外排两个过程保持基本的相对平衡在整个膜泡吞排作用（cytosis）中，必须有能量的保证。例如，膜泡组装形成过程中的小G蛋白，运输过程中的细胞骨架及相应的马达蛋白，以及膜融合过程中Rab蛋白等均发生GTP或ATP的
2、水解反应。,内膜系统(endomembrane systems),内膜系统是指内质网、高尔基体、囊泡、溶酶体和液泡等细胞器。这些细胞器的膜是相互流动的,处于动态平衡,在功能上也是相互协同的。,FM类染料,FM类染料是水溶性的苯乙烯类复合物，对细胞无毒性作用，使用方便常广泛用于质膜和囊泡等的各类研究常用的染料有FM1-43（Ex510/Em626）和FM4-64（Ex558/Em734）。FM类染料与质膜及内膜细胞器特异结合后发出高强度的荧光，需要借助胞吞作用才能进入细胞内。FM4-64在水相中没有荧光，只有插入脂质生物膜后才显示较强的荧光，胞吞回收的囊泡因吞进细胞内部而被荧光标记，利用这种荧光
3、探针能够对细胞的胞吞过程进行有效标记。,FM类染料染色原理,一、材料、试剂,1.材料：烟草悬浮细胞 2.试剂：1）烟草悬浮细胞培养基 2）FM4-64（膜染料）3）叠氮化钠 4）山梨醇 5）ER Tracker-Blue/White(内质网的特异染料),二、实验步骤,取3个共聚焦专用培养皿，分别编号、；往中加入198 L 含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和2 L FM4-64；往中加入178 L含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和20 L山梨醇；往中加入194 L含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和4 L NaN3；,置显微镜下观察中的荧光分布模式；观察完毕中的FM4-64
4、后再往中加入4 L ER Blue/white；往、中分布加入2 L FM4-64，随后先观察中的荧光分布；接着再观察中的荧光分布模式；最后再次观察中FM4-64、ER-Blue/White双染下的荧光分布。,内膜系统及内吞作用的荧光标记观察取3个共聚焦专用培养皿，分别编号、；往中加入178 L含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和20 L山梨醇；往中加入194 L含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和4 L NaN3；往中加入198 L 含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和2 L FM4-64；置显微镜下观察中的荧光分布模式；观察完毕中的FM4-64后再往中加入4 L ER B
5、lue/white；往、中分布加入2 L FM4-64，随后先观察中的荧光分布；接着再观察中的荧光分布模式；最后再次观察中FM4-64、ER-Blue/White双染下的荧光分布。,三、结果与分析,正常BY2 的FM4-64标记 FM4-64先标记于BY2外周，并随着时间的延长逐渐进入细胞内部。,叠氮化钠处理的的BY2 的FM4-64标记 叠氮化钠能抑制BY2的呼吸作用，进而抑制细胞的内吞作用，导致FM4-64不会进入BY2内部，说明FM4-64是通过内吞作用而不是扩散进入BY2的。,质壁分离的BY2 的FM4-64标记 用山梨醇处理BY2 2-3分钟，使BY2发生质壁分离，证明FM4-64是一种膜染料。,ER tracker-Blue/white和FM4-64双标记 细胞膜显示红色，而一部分细胞器显示紫色（红色蓝色叠加）表明内吞的FM染料部分进入内质网。,实验报告1）FM4-64染料可以进行什么生理过程及细胞器的标记？2）你在实验过程中看到的FM4-64/山梨醇预处理及叠氮化钠预处理后再染色的实验现象有何不同，为什么？,
