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1、第10章 动物染色体工程,染色体工程(chromosome engineering)是按照人们的需要对生物的染色体进行操作，添加、削减或替换染色体，从而达到定向育种或创造人工新物种的目的。,1,真核细胞染色体的组成,组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4；非组蛋白：HMG、DNA结合蛋白DNA：不重复序列；中度重复序列；高度重复序列少量的RNA；,从DNA到染色体的包装压缩,DNA链 核小体 螺线管 染色单体 超螺旋压缩比例：76405=8400,（1：7）,（1：6）,（1：40）,（1：5）,Gene Expression,染色体组,染色体组 染色体组型 染色体倍性,体细胞中的一组非同源
2、染色体，它们在形态和功能上各不相同，但是，携带着控制一种生物生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个染色体组。,染色体组型是指一个体细胞中全部染色体的数目、大小和形态特征。,染色体倍性是指细胞中包含的染色体组数或基数。,Human mitotic chromosomes and karyotype,染色体组用符号“X”表示,生物体的体细胞染色体数用2n表示，无论是二倍体还是多倍体，2n只表示体细胞的染色体数，并不表示其倍性，如：玉米体细胞染色体数2n=20，普通小麦体细胞染色体数2n=42，要正确表示倍性应写成：玉米2n=2X=20，普通小麦2n=6X=42。,符号“n”和“
3、X”的区别与联系,10,生殖细胞的减数分裂,骡 子,母马和公驴的后代,11,12,为什么骡子不能繁殖后代？,马的染色体数是64条，驴的染色体数是62条，马的卵子染色体数是32条，驴的精子染色体数是31条，通过精卵结合发育成的新个体骡子的染色体数是63条。骡子的染色体联绘紊乱，因此骡子的生殖细胞不能分化发育成完整的个体。,13,骡子生育的概率极低,骡子性成熟以后，再形成精子或卵子时，每条染色体都没有相对应的同源染色体进行配对，这样每一条染色体分到哪个配子里是随机的，在这些配子中，只有配子里的染色体完全来自于马的，或来自于驴的，这样的配子才有生育能力。,14,狮虎兽（liger）,雄狮和雌虎交配产
4、生的后代。狮虎兽的体型比狮或虎都要大，又同时具备两者之间的外貌特征；狮子与老虎相恋、怀孕的概率极低，即使在人工饲养的环境下，虎、狮受孕的机会也仅为1至2。幼兽由于先天不足等原因，成活率仅为五十万分之一左右。据资料显示，目前世界上存活的狮虎兽只有20只左右。,15,狮虎兽（liger）,16,狮虎兽,狮,虎,虎狮兽,17,动物染色体工程,染色体倍性改造染色体结构改造人工染色体的利用,18,10.1 动物染色体倍性改造,定义：指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术。主要包括：多倍体育种单倍体育种,19,10.1.1 动物的多倍体育种,多倍体（
5、polyploidy）:是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体多倍体产生机制：通过卵细胞第二极体的保留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现,20,10.1.1 动物的多倍体育种,1染色体加倍技术(人工诱导)（1）化学诱导法 秋水仙素 细胞松弛素B（2）物理学方法 1）温度休克法 2）水静压法(3）生物学方法,21,1.化学方法,A.细胞松驰素B(cytochalasin)：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂，使用最早、最广泛，其诱导效果也最突出。B.秋水仙素(colchicine)：主要用于植物阻止细胞分裂过程中的纺缍体的形成，可使染色体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多倍体
6、细胞。C.其他：N2O 特点：化学药物价格昂贵，有毒性,2.物理学方法,A、温度休克法原理：引起细胞内酶构型的变化，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺缍丝所需的ATP供应受阻。抑制第二极体的释放，诱导三倍体或四倍体方法：冷休克法（0-5）和热休克法（30左右）特点：操作简单，成本低廉，对胚胎发育影响小，有利于养殖场大规模生产使用适用：冷水鱼类应用热休克法，温水性鱼类用冷休克效果较好关键：成功阻止第二次成熟分裂和第二极体的排出,2.物理学方法,B、水静压法原理：抑制第二极体的排出或第一次卵裂方法：65kg/cm2特点：诱导率高（90以上），处理时间短，对受精卵损伤小，成活率高。需要专门的
7、设备水压机，成本较高，不适于大规模生产。,3.生物学方法,动物通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体。种间杂交导致第二极体不排出。,草鱼 三角鲂(2n=48)(2n=48)草鲂杂种(3n=72),人工诱导三倍体的方法,直接途径，即用物理或化学的方法对受精卵进行处理，阻碍第二极体外排。（即前述的物理法、化学法）间接途径，即首先诱导获得四倍体，待四倍体个体性成熟后再与二倍体个体交配，从而获得三倍体子代。,26,三倍体 植物,27,28,三倍体 动物,2多倍体的倍性鉴定,（1）直接法 1）染色体计数：是鉴定多倍体的一个准确的直接方法，但比较费时。2）DNA含量测定：细胞DNA含量测定是倍性鉴定的另
8、一个有效的直接方法。（2）间接法 1）核体积测量 2）蛋白质电泳 3）生化分析,30,31,3动物多倍体育种的意义,1）多数具有良好的生长率2）低等动物的种间杂交优势非常明显3）巨大性4）育性低(四倍体可育),32,鱼类三倍体育种的意义,三倍体是非偶数染色体组，阻碍了生殖细胞正常的减数分裂，结果导致性腺不能发育。不育的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发育的能量损耗，所以有以下优点：避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降并延长了上市时间避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加缩短了养殖周期，减少了养殖成本并可养成大型个体,33,利用三倍体鱼类不育性的优点，人们可以达到这样的目的：,获得生长
9、速度较快的三倍体品种，提高鱼类养殖的经济效益 控制养殖鱼类的过度繁殖和防止对天然资源的干扰,34,湘云鲫由湖南师范大学生命科学学院刘筠院士培育,35,36,Triploid Grass Carp三倍体草鱼,37,10.1.2 动物的单倍体育种,1人工单性生殖（1）雌核发育gynogenesis dindenisis（2）雄核发育androgenesis ndrdenisis,38,10.1.2 动物的单倍体育种,1.雌核发育：指精子虽然能正常地钻入卵子中并激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，胚胎的发育仅在母体遗传物质的控制下进行。方法：经遗传失活的动物精子刺激而使卵子发育为正常的二倍体
10、动物。,39,抑制第二极体外排,抑制第一次卵裂,精子遗传物质失活,40,Haploid embryos are generated by mock-fertilizing eggs with UV-irradiated sperm(which cannot contribute genetically),and can survive a few days.Haploids can be rescued by suppressing formation of the polar body with pressure treatment shortly after fertilization.,
11、41,朱洗,细胞学家。浙江临海人。1931年获法国国家博士学位。中国科学院实验生物研究所所长。长期从事两栖类、鱼类、家蚕等动物卵子成熟、受精等研究。1961年使人工雌核发育的雌蟾蜍与雄蟾蜍交配，繁殖出没有外祖父的蟾蜍，证明了单性生殖的高等动物仍保有传代的能力。,42,雌核发育的意义,雌核发育具有产生单性种群的能力迅速地产生同源型二倍体克隆可通过克隆自交，即以激素致使性逆转为雄性，再与同胞姐妹交配，获得强壮的纯系同型配子二倍体，然后借助于雌核发育，产生新的纯系来筛选除去有害的等位基因，以改良近亲繁殖系,10.1.2 动物的单倍体育种,2.雄核发育：用经过紫外线、X线或线处理的卵子与正常的精子受精
12、，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成完全为父本性状的二倍体。定义：遗传失活的卵子与精子结合，发育成只有父本染色体个体的一种特殊生殖方式。,44,人工诱导雌核发育的方法,（1）精子遗传物质的失活 辐射处理（紫外线）、化学物质、直接去除受精卵中的雄性原核（2）细胞分裂的阻止（雌核染色体二倍化）温度休克、静水压力、化学抑制剂处理,45,Heat-shock treatment to activated/fertilized eggs of Indian major carps to induce diploid gynogenesis/polyploidy
13、 respectively,热休克,46,人工诱导雌核发育的方法,（3）雌核发育的鉴别鉴别雌核发育的个体，通常以颜色、形状和生化等方面的指标为根据。目前，还采用细胞学和遗传标记的方法,47,10.2 动物染色体结构的改造,染色体片段的删除和重排染色体的易位工程,48,染色体结构变异,易位：一个染色体上某一区段跟另一非同源染色体上的区段发生互换缺失：染色体的某一区段及带有的基因一起丢失倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。,10.3 人工染色体,人工染色体酵母人工染色体细菌人工染色体哺乳类人工染色体人工染色体的应用,50,人工染色体,染
14、色体要确保在细胞分裂中保持稳定性，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配，需要3个关键序列：1.自主复制DNA序列（ARS）是DNA复制的起点，确保染色体能够开始自我复制。2.着丝粒DNA序列（CEN）确保染色体在细胞分裂时能平均分配到子细胞中。3.端粒DNA序列（TEL）使DNA能结束复制，确保染色体的独立性和稳定性。,51,人工染色体,定义：人工构建的含有复制起始点、着丝粒和端粒三个关键序列的载体系统。,52,现正在研究的人工染色体有三种：酵母人工染色体（克隆容量105-1010bp）（yeast artificial chromosome,YAC）细菌人工染色体（常用于克隆约300bp片
15、段）（bacterial artificial chromosome,BAC）哺乳类人工染色体（mammalian artificial chromosome,MAC）,53,YAC 载体基本序列元件：酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）：负责DNA复制酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）：保证酵母细胞分裂时染色体的分配酵母染色体的端粒顺序（TEL）：维持染色体结构的稳定性（两端各一个）选择标记：用于重组克隆的筛选 pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒，含有Amp大肠杆菌筛选标记,YAC重组载体构建示意图,完整的染色体DNA的提取基因组DNA酶切大片段的获取YAC载体臂的制备YAC臂与目的DNA大片
16、段的连接YAC重组体对酵母的转化YAC基因库的鉴定目的基因YAC克隆的筛选目的基因YAC克隆的鉴定,YAC克隆技术流程,YAC的主要用途是：(1)YAC可容纳大片段的外源DNA，而且在构建基因组文库时需要较少的克隆。(2)用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。目前，用YAC提供大片段DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等动物中得到广泛应用，相比于早期的DNA片段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体。(3)在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用了YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体内表
17、达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥。,YAC的缺点：,1、插入片段大，稳定性较差，不易操作2、插入的大片段常发生缺失，使文库不完整3、YAC与酵母天然染色体分子结构相似分离时难与天然染色体分开4、文库中的嵌合现象严重5、因插入片段大，往往发生序列重排，造成序列错乱。,细菌人工染色体（BAC）,新一代BAC载体为7.4kb的环状质粒，主要结构有：F因子的parA，parB，parC基因 保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞。起始oriS基因 严密控制，决定低拷贝数和复制起始解旋酶基因repC 易于DNA复制和决定复制方向,选择标志基因Cmr 氯霉素抗性基因lac
18、Z基因 颜色鉴别重组子，外源基因插入其中loxP和cosN位点 易于克隆DNA回收和操作,BAC的特点：宿主中只有1-2个拷贝插入片段不易变化，稳定遗传避免嵌合现象转化效率高主要用于300bp一下DNA克隆,60,哺乳类人工染色体（MAC）,以哺乳动物细胞为宿主的人工染色体。,61,YAC和MAC应用于基因治疗领域是一种理想的基因转移新载体，有以下优点：1）可携带的外源基因容量大，包装容量可达500600kb，可以满足几乎所有的单个基因的基因组DNA的需要。2）可以携带较长片段的基因表达调控顺序，能够较好地调节基因表达水平以及基因的靶向表达。3）外源基因存在于人工染色体中，可以不整合到细胞基因
19、组中，因而不会激活原癌基因或使其它有功能基因失活，而且理论上能够在细胞中较稳定地存在。,人工染色体的应用,物理图谱和定位克隆基因功能鉴定和转基因的研究染色体结构和功能关系研究基因治疗,63,第三篇 植物细胞工程,64,植物组织培养,根、芽,完整植株,脱分化,细胞分裂素生长素,再分化,离体的植物器官、组织或细胞,愈伤组织,65,植物细胞工程的主要技术：,植物组织培养植物的快速繁殖体外单倍体诱导与单倍体育种植物胚胎培养体细胞胚胎发生与人工种子植物原生质体融合技术植物染色体工程植物转基因技术,66,思考题,简介动物染色体倍性改造的主要方法。何谓雌核发育？如何人工诱导雌核发育？何谓人工染色体？有何应用价值？请简介鱼类三倍体育种的方法和意义。,67,
