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1、双水相分离蛋白酶,实验目的,1.掌握双水相的概念；2.掌握双水相技术的概念；3.掌握双水相提取酶与蛋白质的原理；4.了解影响双水相技术提取效率的因素。,1956年,瑞典Lund大学学者Albertson首次利用双水相萃取技术(ATPE)分离生物分子。20世纪70年代以后，Hustedt、Kula和Johansson等人又将双水相萃取技术应用于生物产品分离。自20世纪80 年代初期起，双水相萃取技术开始应用于工业生产，国内也开展了相关研究。,人们已经陆续考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在ATPS中的分配行为，从工艺流程、操作参数、成本分析等方面对双水相萃取技术的工业应用进行了分析和尝试，
2、为发展双水相萃取技术奠定了坚实的基础。,当一定浓度的某种有机物水溶液与其它有机物水溶液，或者有机物水溶液与无机盐水溶液以一定体积比混合时，能够自然分相并形成互不相溶的双水相或者多水相体系，这就是双水相体系。,双水相的形成机理很复杂。不同的成相原理可以解释不同组成的双水相体系，但各种原理并不能普遍适用，而且各种原理间的相互关系也十分复杂。,双水相萃取与一般的水/有机物萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同，物质进入双水相体系后，由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用，目标物质在上、下相中的浓度不同，从而达到分离的目的。,溶质(包括蛋
3、白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等)在双水相体系中服从Nernst分配定律:K=Ct/Cb 其中Ct、Cb 分别代表溶质在上相、下相中的浓度。,系统固定时，分配系数为一常数，与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100 或者小于0.01，因此为物质分离提供了可能。,影响物质在双水相体系中分配的因素主要包括双水相体系中有机相组成(如有机物的类型、平均分子量等)、盐类(包括离子类型和浓度、电荷数、电解质强度、酸碱性等)、相比R(
4、上下相的体积比)、溶质即待分离物质的物理化学性质(包括分子量,等电点)以及体系的温度、压力等。,这些因素不是独立起作用的，所以要预测待分离物质在双水相体系间的分配系数相当困难。目前只能是边实验边确定最佳分配条件。,p H的影响,双水相体系中的p H 值可以通过影响蛋白质分子上可离解基团的离解度，从而改变蛋白质的表面电荷数来影响分配，它还可以通过影响缓冲离子如HPO2-4、PO3-4 等的分配，以改变相间电位来达到改变分配系数的目的。不同种类的中性盐也会由于电位差的不同，而导致分配系数与p H 值的关系的不同。,温度的影响,温度的变化也会通过影响相物理性质（如粘度和密度等）的变化来影响蛋白质的分
5、配。但总的来说，温度对分配系数的影响是通过对相图的影响来间接达到的。在临界点附近，温度对相图的影响最显著，对分配系数的影响最强。,当远离临界点时，温度对相图的影响较小，分配系数对温度的变化也不敏感。这是由于远离临界点时，成相聚合物的浓度增大，对蛋白质的稳定作用增强。,中性盐的影响,中性盐的种类不同，其正负离子分配系数也不同。当它在双水相中电离时，为保持两相的电中性，产生了不同的相间电位，从而影响蛋白质的分配。如在PEG-Dext ran 体系中加入NaClO4 或KI，可增加上相对带正电的蛋白质的亲和效应，并迫使带负电的蛋白质进入下相；若加入Li3 PO4，情况则相反。,故只要改变界面电势就可
6、控制荷电蛋白质转入所需要的相中。盐的浓度对分配系数的影响主要反映在对蛋白质疏水性的影响上。,有机共溶剂的影响,在双水相体系中添加少量有机共溶剂，使得体系中的一部分水被有机共溶剂所取代，导致两相界面处的疏水性能差异发生变化，同时界面张力以及电位差也随之改变，从而影响了蛋白质的分配。通常认为，有机共溶剂对被分配物质分配行为的影响，更主要的是有机溶剂和成相高聚物相互作用的结果。,添加表面活性剂可以改变界面张力、上下相组成等两相特性，从而对物质的分配行为进行调节。,双水相萃取技术的优势,双水相萃取通过溶质在两水相之间分配系数的差异而进行萃取。在蛋白质的分离纯化过程中，双水相体系的含水量高，可达80%以
7、上，萃取环境和操作条件温和，蛋白质在其中不易失活；界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力，有助于强化相际间的质量传递；易于按比例放大和进行连续性操作等。,双水相萃取技术的这些优势，使之被广泛用于蛋白质的分离纯化，效果很好。近年来，双水相萃取技术的分离对象已涵盖了多肽、氨基酸、植物有效成分、重金属离子和抗生素等方面。,双水相萃取技术的种类,在生物分离工程中常用的双水相萃取技术（ATPS）有两类。第一类是非离子型聚合物/非离子型聚合物/水系统，第一类体系对生物活性物质变性作用低、界面吸附少，但是所用的聚合物(如葡聚糖)成本较高，而且体系黏度大，在工业化大规模生产时从经济角度丧失了该系统的优
8、势;,第二类是非离子型聚合物/无机盐/水系统。第二类成本相对低，黏度小，但是由于高浓度的盐废水不能直接排入生物氧化池，使其可行性受到环保限制，且有些对盐敏感的生物物质会在这类体系中失活。因此，研究成相材料、建立新型ATPS成为双水相萃取技术的主要发展方向之一。,菠萝蛋白酶（bromelain）是从菠萝的果实和茎中制取分离出的蛋白水解酶的总称，根据制取分离部位的不同，分为果菠萝蛋白酶（fruit bromelain）和茎菠萝蛋白酶（stem bromelain）。,1891年，Chittenden等首先用硫酸铵沉淀法从菠萝果实中分离出了果菠萝蛋白酶。1957 年，Heineche 等从菠萝茎中制取蛋白水解酶，从此菠萝蛋白酶实现了商品化生产。,菠萝蛋白酶中含有多种不同蛋白水解酶组分，对多种蛋白质及多肽具有催化水解活性，在医药上主要用于抗炎、消除水肿、烧伤后脱痂等；食品工业上用于啤酒澄清、肉类嫩化及水解蛋白的生产等。,蛋白酶水解酪蛋白得到的酪氨酸，在波长275nm处有最大光吸收，通过测定反应体系中此光吸收值的变化，可以测定蛋白酶活性。,
