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1、污水厌氧处理技术四环素是一类水体中常见的广谱抗生素,它能与核蛋白体的30S亚单位结合,阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合割制蛋白质的合成。同时,四环素类药物的广泛使用引起了四环素耐药细菌在环境中产生并快速传播。至今,被发现的四环素耐药细菌有115属、530种。不同来源废水中四环素的含量差异较大,一般含量在几十ngL-l到几百gL-l之间。近年来,四环素对污水处理系统的影响引起了广泛关注。Cetecioglu等在sbr中通过测定cod的含量和气体的产量的变化发现，当四环素投加量低于8.5mgL-l时,反应器内底物降解作用不受影响,但产气量减小了10%20%,说明四环素对系统中微生物造成了影响。AY
2、DIN等在ASBR中通过测定甲烷产量和挥发性脂肪酸的积累量的变化发现,不同浓度组合的四环素、红霉素和磺胺对同型乙酸菌和产甲烷菌产生了不同程度的影响。AYDIN等在随后的研究中又分别运用了real-timePCR和PCR-DGGE分子生物学技术发现,四环素、红霉素、磺胺3种抗生素共同影响下产乙酸细菌和产甲烷古菌存在互营关系且这种互营关系对反应器的稳定运行起关键作用。随着分子生物学技术的发展,高通量测序技术已被广泛使用在研究土壤、海洋、污水、活性污泥的群落结构中。第2代IIIuminaMiSeq高通量测序能克服传统检测方法的缺陷,具有通量高、错误率低、成本低、流程自动化、速度快等优势,目前已在研究
3、微生物多样性群落结构方面受到广泛认可；因止匕，将IIIuminaMiSeq高通量测序方法应用于污水处理系统的研究,对深入认识污水处理系统具有实际意义。当前,污水厌氧处理因其高效能、低能耗等特点在污水处理工程上开始受到关注。它实际上是借助于不同微生物种群间的协同作用,通过水解一酸化（产氢及产乙酸）一产甲烷等一系列生物反应将有机底物转化为甲烷和无机物的过程。在这个过程中,微生物群落构成直接影响到污水处理的效果,因此,深入认识污水厌氧消化系统的微生物群落构成,对厌氧污水处理系统的稳定运行具有指导作用。基于此,本研究通过室内模拟实验,选择ABR多相厌氧反应器进行连续流实验启动反应器达到稳定状态后,分别
4、在不含四环素和含有250gL-l四环素的人工配制污水条件下运行90d,通过考察来自反应器的氢气、甲烷产生量的变化,运用IIIUminaMiSeq高通量测序方法对反应器中的微生物群落构成进行分析,研究四环素对污水厌氧处理系统微生物群落造成的影响,以期从微生物关系角度深入了解这种影响,为污水厌氧处理技术研究及工程实践提供参考。1、材料和方法1.1 实验装置ABR采用厚为5mm的有机玻璃板加工制成,尺寸为455mm15OmmX40Omm,有效容积为21L置于(351)。C的恒温箱中。反应器分为3个格室,按照前后顺序分为格室1、格室2、格室3,分别命名为CLC2、C3,每个格室由上、下流室(体积比为3
5、:1)组成,折流板底角为45oo格室体积比Vl:V2:V3=1.5:1:Ie每个格室上部设有集气口,侧部分别设有取水口、取泥口。1.2 接种污泥接种污泥取自某市沥窖污水处理厂A2/O工艺的厌氧池。污泥MLSS=24.67gL-lzMLVSSMLSS=0.61zpH=6.58z含水率为97.30%o接种污泥体积为反应器有效容积的l3o1.3 实验用水配水以葡萄糖为碳源,NH4CI和KH2PO4分别为氮源和磷源洞时加入Ca、Mg、Fe.Co.Ni等微量元素,以保证微生物细胞合成的需要。此外,向配水中投加一定量的NaHC03以保证ABR内的缓冲能力。反应器以连续流方式进水,水力停留时间(HRT)为2
6、4ho在启动阶段，采用逐步增加进水负荷的启动方式，进水COD浓度为5002000mgL-l,当COD去除率稳定在80%以上、出水各项指标(pH、碱度、VFA)趋于正常,启动阶段完成。反应器的运行先后经历了启动阶段(56d)、稳定运行阶段(90d)、添加四环素(250gL-l)运行阶段(90d)。1.4 DNA的提取和PCR扩增及其微生物多样性数据分析分别在反应器的稳定运行阶段和添加四环素运行阶段每间隔18d从每个格室采集一次活性污泥样本,分别命名为CtrlDI8C1、CtrlD36ClsCtrlD54ClxCtrlD72ClxCtrlD90ClxTreD18ClxTreD36ClxTreD54
7、Cl.TreD72ClxTreD90C1,其中Ctrl代表未添加四环素运行时的污泥样本，Tre代表添加四环素运行时的污泥样本，D18代表第18天取样，C1代表样本取自格室L格室2和格室3的样本命名为C2和C3o实验共从3个格室中共采集到30个活性污泥样本。分别称取0.4g污泥用于DNA提取。采用MOBIOPowerSoilDNAIsolationKitDNA提取试剂盒进行DNA提取,提取步骤依据说明书操作,提取好的DNA保存于-20。C冰箱。以提取的基因组DNA作为模板,使用16SrRNA基因V4区特异性引物F515和R806进行PCR扩增,扩增片段长度约为300bpo本实验采用50L的PCR
8、反应体系:lpL模板,各lL的10molL-l正向引物和反向引物反大),0.2L20mgmL-0的蛋白质(TaKaRa)z25L的PremIxExTaqVersion(ExTaqVersio2.OpIusdye)(TaKaRa)z21.8L灭菌水(TaKaRaKPCR的反应条件:945min;9430s,5230sz72oC45sz31个循环;72。Clomin。将各样品的PCR产物按照等摩尔量进行混合，使用QIAqUiCkGelEXtraCtiOnKit(Qiagen,Chatsworth,CA,USA)凝胶回收试剂盒切胶回收PCR混合产物,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,最后使用IIIumi
9、naMiSeq高通量测序平台进行基因测序。测序结束后,首先,使用TrimmOmatiC(VerSiono.33)软件去掉序列3端连续的低质量碱基。接着,用MOthUr(VerSionL35.1)中的make.Contigs命令将两端reads拼接成完整的目的DNA片段,再用screen.seqs,trim.seqs命令进行错误序列的识别和修剪。最后,使用QnME软件对测序数据进行微生物的多样性分析,将得到的序列进行聚类,将97%相似性的序列聚类成为OTus(Operationaltaxonomicunits)。物种分类由UCLUST(Version1.2.22)软件和GreengenesOTU
10、数据库(gg_13_8_otus)实现。1.5 反应器气体产生的分析于固定时间每6d测定一次格室内产生气体中氢气和甲烷的含量,检测方法为气相色谱法。使用仪器为安捷伦782OA气相色谱仪，检测器为TCD,色谱柱为TDX-OL色谱条件如下:进样口、色谱柱、检测器的温度分别为100.100和200。载气为氮气,流量为35mLmin-l;进样量为ImLo2、结果和分析2.1 四环素对反应器内气体产生的影响ABR3个格室中氢气的产生情况如图2所示。仅在格室1中检测到氢气的存在,而格室2和格室3中没有检测到氢气的产生,这主要是由于格室1进行的是产氢产乙酸反应,而后端格室主要进行的是产甲烷反应。未添加四环素
11、运行时,格室1内氢气的平均产量为00102L(gd)T(以MLSS计)。添加四环素后,氢气产量是未添加四环素时氢气产量平均值的4.056.89倍。说明四环素的添加能使氢气产量增加。ABR3个格室甲烷产生情况,如图3所示。在未添加四环素时,格室L格室2、格室3的甲烷平均产量分别为0.3204、0.1462、0.0881L(gd)T(以MLSS计)。显然,甲烷产量在纵向上呈降低的趋势。这与反应器内的底物分配有关,格室1进水有机物含量较高,随着格室内微生物的降解作用,有机物含量在纵向上随着格室逐渐降低,有机物的减少使得甲烷产量在格室间纵向减小。添加四环素后,格室1、格室2、格室3的甲烷产量随着运行时
12、间的推移呈现不同程度的下降,分别是未添加四环素时对应甲烷平均产量的4390%8020%、2728%7979%、38.24%83.70%o通过对比四环素添加后同一个格室不同时间的甲烷产量变化,发现甲烷产量随着运行时间的推移呈现下降趋势,说明四环素对产甲烷的抑制作用随着时间的推移增大。2.2 微生物丰度分析通过反应器中获取的DNA序列与GreengenesOTU数据库进行比对,得出反应器中微生物主要有16个属,如图4所示。分别为甲烷杆菌属(MethanobaCteriUm)、密螺旋体属(TrePOnema)、寡养单胞菌属(StenotroPhomonaS)、不动杆菌属(Acinetobacter)
13、x脱硫弧菌属(DesuIfovibrio)x长绳菌属(LongiIinea)x丛毛单胞菌属(Comamonas)、互营杆菌属(Syntrophobacter)x梭菌属(CIostridium)x浮霉状菌属(PIanctomyces)xBlvii28xPaludibacterxAUTHM297xWCHB1-O5sAI7、W22o图4可知,随着四环素的添加,不同物种呈现出不同的变化趋势。其中,随着四环素的添加,密螺旋体属(TrePonema)、脱硫弧菌属(DesuIfovibrio)x互营杆菌属(SyntroPhobaCter)、W22的丰度在3个格室内均呈现增长的趋势,说明密螺旋体属(TrePo
14、nema)、互营杆菌属(SyntroPhobaCter)、脱硫弧菌属(DeSUlfoVibrio)、W22对四环素具有一定耐药性。密螺旋体属(TrePonema)能利用氢气和二氧化碳转化成乙酸。添加四环素后,如表1所示,格室L格室2、格室3内的密螺旋体属(Treponema)分别是未添加四环素时相应密螺旋体属(TrePonema)平均丰度的L092.00倍、1.271.79倍、1.41-6.52倍,密螺旋体属(TrePonema)丰度的增加说明四环素的添加能促进氢气和二氧化碳转化成乙酸的过程,有利于乙酸的积累。有研究表明,乙酸是微生物燃料电池生产电能的首选底物,It生物质可产出价值150美元的
15、乙酸,却只能产出31美元的甲烷；因止匕,在处理四环素污水时，可以充分利用密螺旋体属(TrePonema)的优势,增加乙酸积累,可以通过耦合系统将乙酸转化为微生物燃料电池能源或作为发酵工业的原料,实现资源回收。互营杆菌属(SyntrOPhobaCter)是一类产氢产乙酸细菌,能将高级脂肪酸和醇类氧化分解为乙酸和H2o添加四环素后,如表1所示,除了格室1第18天和格室3第54天的互营杆菌属(SyntroPhObaCter)比未添加四环素时平均丰度低,这可能是由于反应器运行过程中其他条件扰动引起的,其他时间内格室L格室2、格室3内的互营杆菌属(SyntrOPhobaCter)分别是未添加四环素时相应
16、互营杆菌属(SyntroPhobaCter)平均丰度的L372.04倍、LOo3.95倍、L482.98倍,互营杆菌属(SyntroPhC)bacter)丰度的增加说明四环素的添加有利于产氢过程,与2.1中氢气产量增大的结论相印证。氢气是一种清洁能源,具有燃烧热值高、燃烧产物无污染的特点,具有很好的应用价值;因此,在处理四环素污水时,可以加强氢气的回收利用,减小污水处理成本。脱硫弧菌属(DeSUIfOVibrio)是一类硫酸盐还原菌,它能利用金属表面的有机物作为碳源,将硫酸盐还原成硫化氢,加速金属管材的腐蚀。添加四环素后,如表1所示,格室L格室2、格室3内的脱硫弧菌属(DeSUlfOVibri
17、o)分别是未添加四环素时相应脱硫弧菌属(DeSUIfOVibriO)平均丰度的1.09-3.99倍、1.12-3.59倍、1.20-7.40倍,脱硫弧菌属(DeSUlfOVibriO)丰度的增加说明四环素的出现会加剧污水处理系统中金属管材的腐蚀;因此,在处理四环素污水时,应充分重视处理系统中金属管材的防腐措施,减少因脱硫弧菌属(DeSUIfOVibrio)增多而造成的损失。格室1内的寡养单胞菌属(StenOtrOPhe)monas)和不动杆菌属(Acinetobacter)x格室3内的梭菌属(CloStridiUm)和甲烷杆菌属(MethanobaCteriUm)随着四环素的添加,丰度先减小后
18、增加，如表2所示,在四环素添加初期,这些微生物物种在相应格室内受到的抑制作用较大,随着时间的推移,所受抑制作用减弱,耐药性增加,说明四环素的长期污染能使微生物的耐药性发生改变。表1丰度随四环素添加而增大的物种的丰度变化值表2丰度随四环素添加先减小后增大的物种的丰度变化值2.3 样本的主坐标分析(PCoA)和聚类分析主坐标分析(PCC)A)能展示各个样本间的差异大小,2个样本在坐标轴上的距离较近厕表示这2个样本的物种组成较相似。图5反映了未添加四环素时和添加四环素后样本间物种的差异大小。可以看出,主成分I(PCI)和主成分2(PC2)是造成样品的2个最大差异特征,贡献率分别为25.82%和11.
19、86%。未添加四环素时,CLC2、C3的样本分别聚在一起,Cl和C2样本之间距离较近,且和C3距离较远,说明未添加四环素时,Cl和C2的物种相似性较高，且这2个格室的物种和C3格室物种有一定差异。添加四环素后,Cl和C3物种在初期有个渐变的过程,后期3个格室的样本聚在一起,且与未添加四环素时有一定距离,说明四环素添加前后格室内物种有较大差异,且随着四环素的添加,3个格室间的物种组成相似性提高。样品聚类分析图(图6)进一步说明PCoA的结果,样品越靠近,枝长越短,说明2个样品的物种组成越相似。由图6可以看出,未添加四环素时,Cl和C2格室样品距离较近,枝长较短,说明这2个格室间物种相似性较高,而
20、C3格室的样品在另一个分支上,距离较远,枝长较长,说明C3格室的物种与CLC2格室的物种具有一定的差异。随着四环素的添加,Cl和C3样本在初期有个远离的过程,说明物种有个渐变的过程,在后期3个格室的样本距离缩短，相互间枝长变短,说明在后期3个格室物种相似性增大,且添加四环素后的3个格室样本与未添加四环素时的样本分别位于不同的大分支上,说明四环素的添加使反应器内微生物产生较大变化。主坐标分析(PCoA)和样品聚类分析共同说明了四环素添加前后反应器内的微生物的物种组成具有较大差异,四环素添加后,随着运行时间的推移,格室间微生物的物种组成相似性增大。产生这种现象主要原因是:由于四环素耐药物种的存在,
21、使四环素添加后不具有四环素耐药性的物种逐渐被四环素耐药物种取代,随着运行时间的推移,各格室内耐药物种增多,所以格室间物种相似性增大;由于耐药物种逐渐取代了不耐药物种,所以四环素添加前后反应器内微生物物种组成有较大差异。说明长期受抗生素污染的污水处理系统对微生物具有选择性,使微生物群落结构发生变化,进一步说明通过污泥驯化能减小抗生素对污水处理系统的不利影响。3、结论本实验采用实验室人工配置污水,对具有3个格室的ABR进行连续流实验,启动反应器达到稳定状态后,分别在无四环素配置污水和浓度为250gL-l的四环配置污水环境下运行反应器90d,探讨2种条件下氢气(H2)、甲烷(CH4)产量的变化，并运
22、用IIIuminaMiSeq高通量测序方法从微观上揭示上述变化的原因。主要研究结果如下：1)四环素的添加能使氢气产量增加,四环素对产甲烷的抑制作用随着时间的推移增大;2)IIIUminaMiSeq测序获得反应器内的序列所属16个属，其中，密螺旋体属(Treponema).脱硫弧菌属(DesuIfovibrio)s互营杆菌属(Syntrophobacter)xW22对四环素具有一定耐药性格室1内的寡养单胞菌属(StenOtroPhomonaS)和不动杆菌属(Acinetobacter)x格室3内的梭菌属(CloStridiUm)和甲烷杆菌属(MethanObaCteriUm)对四环素的耐药性随着
23、四环素污染时间的推移,耐药性增加,说明四环素长期的污染能引起微生物的耐药性发生改变;在处理四环素污水时,可以通过以下调控趋利避害:充分利用密螺旋体属(TrePonema)的优势,增加乙酸积累,可以通过耦合系统将乙酸转化为微生物燃料电池能源或作为发酵工业的原料,实现资源回收,在处理四环素污水时,可以加强氢气的回收利用,减小污水处理成本;硫弧菌属(DeSUlfOVibr增多会加剧污水处理系统中金属管材的腐蚀,因此应充分重视处理系统中金属管材的防腐措施,减少因脱硫弧菌属(DeSUlf。Vibrio)增多而造成的损失;4)PCoA分析和聚类分析结果表明,四环素添加前后系统内物种组成具有较大差异,四环素的添加引起了具有四环素耐药性物种逐渐取代不具有四环素耐药性物种,随着运行时间的推移,格室间物种相似性增大,说明长期受抗生素污染的污水处理系统对微生物具有选择性,使微生物群落结构发生变化,进一步说明通过污泥驯化能减小抗生素对污水处理系统的不利影响。
