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1、Tools for Functional Analysis,Knockouts,Dominant Negative(显型负 突变)Antibodies Aptamers(寡核苷酸适配子),Antisense Ribozymes siRNAs,Demonstration of a casual role of a gene in the initiation,maintenance,or modulation of a phenotype by selective decrease(knockdown)or lack(knockout)of gene function.,Gene of Inte
2、rest,Gain of Function Loss of Function,六、基因剔除技术（一）基因剔除技术的概念基因剔除（gene knock out）或基因靶向(gene targeting)灭活是将生物体中某一特定的基因功能给破坏，再研究当生物体缺少这个基因在生长发育的过成中会有怎样的改变，或是会好发怎样的疾病。,原理：利用细胞复制分裂时，染色体进行联合互换发生同源重组homologous recombination）,Prdx1 gene,ES cell,胚胎,杂合子Prdx+/-,纯合子Prdx-/-,Prdx1+/+:wide type mice(N=34)Prdx1+/-：P
3、rdx1 heteroxygous mice(N=88)Prdx1-/-：Prdx1 knock out mice(N=64),Sourthern blot-DNA,Nothern blot-RNA,Generation of Prdx1-/-mice,进入多重防护的SPF动物室,检查受精母鼠,取胚,胚显微注射,DNA显微注射,显微注射完成,胚植入输卵管,养殖小鼠,动物饲养,（二）基因剔除技术的应用,阐明特定基因功能、基因间相互作用,阐明基因结构与功能异常在疾病发生、演进和归转中的作用，即疾病分子调控机制,在精确的时间、组织打开或关闭特定基因,可对基因进行单个碱基或大片段的修饰,确定药物作用的
4、分子靶点，有效筛选新药,Model Organisms Used in Functional Genomics,Major Events in the Development of Gene Targeting,骨保护蛋白(Osteoprotegerin,OPG),+/+,-/-,转基因鼠,基因剔除鼠,骨硬化,骨质疏松症,Procedure of Knockout Mice,七、RNA干扰技术（一）RNA干扰技术的概念生物体内，双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，能识别含有其互补序列的mRNA并与之结合，在酶的作用下降解mRNA，从而干扰相应基因表达。这一现象称为
5、RNA干扰(RNA interference，RNAi)。,RNAi在生物抵御病毒感染、维持基因组中转座子的稳定以及某些生物生殖细胞的发育过程中都起着重要作用。,（细胞膜）,（细胞核）,（细胞质）,基因的表达,转录,翻译,（转运RNA）,（核糖体RNA）,RNAi现象的发现,1995年，康奈尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达，但是奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，也同样阻断了该基因的表达。,Guo S,Kemphues KJ.par-1,a gene required for e
6、stablishing polarity in C.elegans embryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed.Cell.1995;81(4):611-20.Section of Genetics and Development,Cornell University,Ithaca,New York 14853,USA.,外源导入或者转基因表达反义RNA，抑制rRNA和tRNA的翻译。,Fire等(1998)发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达,并证实这种抑制主要作用于
7、转录之后，所以又称转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)。该课题组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）。,Fire A,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in C.elegans.Nature.1998;391(6669):806-11.,（二）RNA干扰技术的原理（3步骤）,dsRNA的形成,siRNA的形成,RNAi的形成,靶基因mRNA,siRNA的反义链,RNAi是生物体抵御外源遗传物
8、质入侵的自我 保护机制。,mRNA被酶切破坏，性状无法表达。,dsRNA：外源或内生，或病毒或其他双链RNA；或异常RNA由RdRP催化合成双链RNA,siRNA,Dicer核酸酶,特异性蛋白结合，siRNA解链,活化的siRNA复合体(RISC),靶基因的mRNA,siRNA,Dicer核酸酶,核酸酶降解mRNA,RdRP,催化合成新的双链RNA（dsRNA）,以反义siRNA为引物,3,5,5,5,3,3,5,随机降解性聚合酶链式反应（random degradative PCR）,Initiation Step,ATP,ATP,ADP+ppi,ADP+ppi,DICER,KINASE,R
9、dRP,Effector Step,siRNA bindingsiRNA unwindingRISC activation,Dicer,siRNA,5,3,5,3,RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）的组成,2 RNA binding proteinsRNA/DNA HelicaseTranslation Initiation FactorRNA-Dependent RNA Polymerase(RdRP)Transmembrane Protein,Vectors expressing siRNAs,U6,H1,siRNA,Vectors
10、 expressing siRNAs,U6,Sense sequence,Anti-sense sequence,Hair-pin loop,（二）RNA干扰技术的应用1用于功能基因组分析随着人类基因组计划的完成，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因功能、基因表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。,RNAi可以高通量分析植物的全基因组基因。在水稻和拟南芥的基因组测序完成后，人们获得了众多的候选基因，RNAi为注释和认识这些基因在植物体中所起的作用提供了一种快速、高效的鉴定方法。,2用于生物遗传改良,随着生活水平的提高，人们对植物产品品质的要求也日益提高。
11、例如油料产品中的硫甙含量、不饱和脂肪酸的含量，咖啡中的咖啡因的含量等。而传统育种很难同时改变作物多个品质性状。人们对一些生化物质代谢途径的认识使得分子改良成为可能。,RNAi的功能之一是保护基因组不被可移动的基因元件如转座子或病毒RNA的侵犯，RNAi效应为植物中利用siRNA抗病毒提供了广阔的前景。以靶mRNA为模板的PCR模式尤其适用于抗变异病毒：只需要根据病毒保守的序列设计siRNA，就可抑制所有的变异病毒。,3用于基因治疗,RNAi可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。在治疗病毒性疾病的研究中，可以设计针对病毒基因组RNA的siRNA或针对宿主细胞病毒受体的si
12、RNA来抗病毒。针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、呼吸道合胞体病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、HIV-1、SARS等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用。,2003年爆发的非典型肺炎给人类健康带来极大的危害，引起全球关注。2005年，中美科学家根据RNA干扰的原理研制出了一种可有效抑制SARS的新疗法：利用小型RNA片段阻碍基因的表达，即RNA干扰(RNAi)。,冠状病毒基本结构,SARS病毒核心为螺旋状排列的RNA及衣壳（N蛋白）组成的核壳体，其外为包膜。N蛋白是SARS病毒重要结构蛋白，在病毒转录、复制和成熟中起作用。病毒包膜S蛋白的功能是与细胞受体结合，使细胞发生融合，是SARS冠状病毒侵染
13、细胞的关键蛋白。,乙肝病毒的结构,针对乙肝病毒的RNAi技术可能治疗乙肝,RNAi用于肿瘤的治疗,生存素(survivin)在细胞凋亡和周期调控中发挥重要作用。许多恶性肿瘤的生存素基因表达增高，而正常组织无表达。,赵伟红，郭俊明，等.生存素siRNA表达质粒对MGC-803细胞细胞周期和增殖的影响.世界华人消化杂志，2005，13：2302-2305,空白对照 转染试剂 空载质粒 siRNA质粒,采用RNA干扰技术抑制胃癌细胞的生存素基因表达,RT-PCR 流式细胞仪检测,（三）RNAi的优点简单易行，容易开展,与基因敲除相比实验周期短，成本低,与反义技术相比具有高度特异性和高效性,可进行高通量基因功能分析,
