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1、,第三章 基因克隆与表达的载体,vectors,基因克隆过程,？vectors 本质？,在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。,1.载体(Vectors),载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连，导入受体细胞，而且还能利用本身的调控系统使外源基因在新的细胞中复制。,1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 Within the host cell the vector multiplies,producing numerous identical copies n
2、ot only of itself but also of the gene that it carries.,载体的功能：,（2）在宿主细胞内能独立复制。replicate independently in host cell,（3）有一段多克隆位点。Multiple cloning sites 外源DNA插入其中不影响载体的复制。,2.基因工程对载体的要求,（4）有选择性标记。selectable marker（5）分子量小，拷贝数多。Low molecules and multiple copies（6）容易从宿主细胞中分离纯化。Easy isolation and purificati
3、on from host cells.,（1）具有对受体的可转移性。transferable,复制位点选择性标记克隆位点,克隆载体,表达载体,表达调控元件,必须的,3.基因工程对载体的要求组成部分,基因工程中常用的载体有4类：,3.载体的种类,质粒（plasmid）单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus）,第一节 克隆载体,一、质粒（plasmid）,存在于多种宿主细胞中、独立于染色体以外的可自主复制的双链闭合环状DNA分子。,存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,大肠杆菌的质粒,质粒的命名规则,天然存在的质粒：其符号的第一个字母要大写，并不用斜
4、体字，书写时要用括号括起来，如（ColE1）。重组质粒：通常是用小写p后加两个大写字母表示.,（一）质粒（Plasmid）的命名,构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机构,例如：pSC101,pSC101,plasmid 质粒,质粒试验研究类号,Stanley Cohen,（一）质粒（Plasmid）的命名,（1）分子小：,（二）质粒的一般生物学特性,1-200 kb,质粒DNA仅占细胞染色体组一小部分，一般约1-3左右。不同质粒DNA的分子量差异相当显著，质粒DNA分子小的不足2 kb，大的可达100 kb以上，多数在10 kb左右。最小的仅能编码23种中等大小的蛋白质，两者之间相差竞达上
5、百倍。,（二）质粒的一般生物学特性,（2）编码基因少：,2-3个中等大小的蛋白质。,（3）环状：,双链环状DNA。,如抗生素抗性等，赋予细菌一些额外的特性。,（非必须）,（4）质粒的空间构型：,共价闭合环状DNA（cccDNA),呈超螺旋（SC）（super coil）,Covalent close circular DNA,线形DNA（linear，lDNA）,一条链上有一至数个缺口。,开环DNA（open circular，ocDNA）,（5）质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,l DNA
6、,（三）质粒的基本性质,（1）严紧型质粒（stringent plasmid）,拷贝数少，只有1-3个拷贝。,（2）松弛型质粒（relaxed plasmid）,拷贝数多，一般10个以上。,（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。,1.复制,p39,质粒的拷贝数：指在正常生长条件下，每个细菌细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。,（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）,2.不相容性（incompatibility）,在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥(稀释)掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。前提条
7、件：只有在确实证明第二种质粒B已经进入含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳定共存，在这种情况下，我们才能够说A和B是不亲和的质粒。,在大肠杆菌中的质粒，可以分为：,3.质粒的转移性,（1）接合型质粒,（2）非接合型质粒,能自我转移,不能自我转移,如：F质粒（性质粒、或F因子）：,甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。,通过接合作用转移到新宿主内，又叫自我转移型质粒。,（1）接合型质粒（conjugative plasmid）,分子量大，拷贝数少，宿主广，不符合基因工程的安全要求,除了带有自我复制所必需的
8、遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因,大肠杆菌接合（conjunction）,Plasmid transfer by conjugation between bacterial cells.,（2）非接合型质粒（non-conjugative plasmid）,R质粒（抗性质粒）,带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。,分子量小，拷贝数多，符合基因工程的安全要求,虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。,带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因,Col质
9、粒,大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。,但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，非接合型质粒也可以被转移。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。,（1）如：分子量大，拷贝数低,（四）质粒载体的构建,1、天然质粒的局限性,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。,有一个EcoR I酶切位点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。,ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）,（2）筛选标志不理想,可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞.,colicin E1能杀死不含Col
10、E1 质粒的菌。,2、质粒载体的构建：,（1）具有复制起始位点（ORI）,（2）具有合适的选择标记基因,（3）若干限制性内切酶的单一位点（MCS）,是筛选的标志。理想的载体应该有两种选择标记基因,用来插入外源DNA片断，且插入后不影响复制功能,一般选择组装松弛型质粒复制起始位点。,（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数,缩短长度“轻装上阵”，大于15 kb的质粒的转化率明显下降,氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）,3、质粒的选择标记及其工作原理,（1）选择标记,绝大多数质粒载体都是用抗生素抗性标记：,抗生素抗性,常
11、用抗生素的抗性原理,i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生物。,通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。,a）抑菌原理,b）细菌抗性原理,Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。,ii）氯霉素（Chloramphenicol，Cml）,通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。,b）细菌抗性原理,Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。,a）抑菌原理,iv）链霉素（Streptomycin，Str）,通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。,v）四环素（Tetracycline，T
12、et）,通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。,iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）,通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。,遗传标记,使受体菌发生遗传性状的改变的基因。,当带有抗生素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。,不带有抗生素抗性基因的受体菌不能在含有抗生素的培养基（选择培养基）中生长。,（2）抗生素选择原理,活,死,抗性基因,抗生素,4、人工构建的质粒载体的类型,（1）高拷贝数的质粒载体,ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。,而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，
13、达到每个细胞的拷贝数1000-3000个！质粒DNA含量可达细胞DNA总量的40-50。,适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。,Plasmid amplification,（2）低拷贝数的质粒载体,但有特殊用途:,由pSC101派生来的载体，分子量小，拷贝数低。,当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。,pLG338、pLG339、pHSG415等,不适合大量扩增DNA用。,（3）失控的质粒载体,这是一类温度敏感型复制控制质粒。,温度低（低于37 oC），拷贝数很少；温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到100
14、0个以上。,如pBEU1、pBEU2。,runaway plasmid vectors,1979年B.E.Uhlin等构建。,（4）插入失活型质粒载体,载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。,如pDF41、pDF42、pBR329。,抗生素抗性,外源DNA,无抗生素抗性,（5）正选择的质粒载体,如pUR2、pTR262等。,只有带有选择标记基因的转化菌细胞，才能在选择培养基上生长。,直接选择转化后的细胞。,目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。,Direct selection vectors,（6）表达型质粒载体,主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。,如果在大肠杆菌里表达，必须把
15、所克隆的基因置于大肠杆菌的转录-翻译信号控制之下。,注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。,复制起始点ORI 选择标记 多克隆位点MCS,2）大肠杆菌操纵子元件,阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。,1）普通克隆载体元件,表达载体的结构,质粒载体的选择,理想质粒载体应具备的条件*,replicate independently single sites for a large number of restriction endonucleases selectable marker low molecular weight,mult
16、iple copies;缺少mob基因 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。,（五）经典的大肠杆菌质粒载体,1.pSC101,第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。,（1）类型,天然质粒，属低拷贝型。,（2）长度,9.09 kb,（3）选择标记,四环素抗性Tetr,6个克隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。,（4）克隆位点,（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于、Tetr内部）,2.ColE1,（1）类型,天然质粒，属高拷贝型。,（2）长度,6.3 kb。,（3）选择标记,特点
17、是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！,大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）,colicin E1基因的结构,cea,imm,kil,结构基因,免疫基因,溶菌基因,杀死不含有ColE1细菌的原因,cea+kil基因产物,不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因,imm基因,EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。,EcoR I,（4）克隆位点,Colicin E1,外源DNA,无Colicin,用对外源co
18、licin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产生抗colicin E1的频率很高！,（5）ColE1的选择缺陷,ColE1,抗 colicinE1,杀ColE1-,仍抗 colicinE1,不杀ColE1-,插入片断,ColE1,复制位点选择性标记克隆位点,克隆载体,表达载体,表达调控元件,必须的,基因工程载体的组成部分,上节内容回顾,严紧型：松弛型：,拷贝数,是否转移,质粒的基本性质,上节内容回顾,接合型：非接合型：,1-3个拷贝10个以上,F质粒，不安全 R 质粒，安全 Col质粒,不相容性,在没有选择压力的
19、情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不相容质粒。,如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，非接合型质粒也可以被转移。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。,质粒的迁移作用,人工构建的质粒载体的类型,（1）高拷贝数的质粒载体：ColE1、pMB1,上节内容回顾,（2）低拷贝数的质粒载体：pSC101派生的载体,（3）失控的质粒载体：温度敏感型复制控制质粒,温度低（低于37 oC），拷贝数很少；温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以
20、上。,人工构建的质粒载体的类型,（4）插入失活型质粒载体,上节内容回顾,（5）正选择的质粒载体,（6）表达型质粒载体,抗生素抗性,外源DNA,无抗生素抗性,理想质粒载体应具备的条件,replicate independently single sites for a large number of restriction endonucleases selectable marker low molecular weight,multiple copies;缺少mob基因 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。,上节内容回顾,经典的大肠杆菌质粒载体,1.pSC101,上节内容回顾
21、,经典的大肠杆菌质粒载体,2.ColE1,上节内容回顾,（1）天然质粒，高拷贝，可氯霉素扩增,（2）长度6.3 kb。,（3）选择标记：大肠杆菌素E1 对E1免疫的基因,pSP2124质粒的Ampr基因,3.pBR322,（1）元件来源,分子克隆之父Boyer的两个博士后Bolivar和Rodriguez构建,复制起点 ori,来源于质粒pMB1系列，高拷贝型复制起点,Ampr基因,Tetr基因,pSC101的Tetr 基因。,（2）长度,4363bp,（3）选择标记,氨苄青霉素和四环素抗性。,（4）克隆位点,其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Sal I）；3个会导致Ampr基因
22、失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,24个克隆位点。,（5）pBR322的优点,双抗生素抗性选择标记,没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。,获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。,插入失活，分两次先后选择：,外源基因BamH I,Amp中存活,但在Tet中死亡,外源基因Pst I,Tet中存活,但在Amp中死亡,氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000 copy，达细胞DNA总量的4050,安全,失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。,高拷贝数,分子小，克隆能力大,4361bp，载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中
23、容易断裂。,（6）pBR322的缺点,保留了转移蛋白（bom）的作用位点。,部分质粒虽不含tra基因，但含有bom位点（oriT），当宿主细胞内同时含有mob基因的辅助质粒时，mob基因的产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助于接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，发生迁移作用。,4.pUC系列,University of California的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属于正选择载体。,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19,复制起点,pBR322的 ori,但其上失去了克隆
24、位点。,Ampr 基因,（1）元件来源,lacZ的启动子,大肠杆菌,lacZ基因,大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是lacZ 的5末端片断，用于蓝白斑筛选。,pBR322的Ampr基因,（2）长度,约2686bp,（3）克隆位点,10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。,pUC18/19,Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。,（4）选择标记,蓝白斑筛选原理：,X-gal,-半乳糖苷酶显色底物,（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）,（5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷）,-半乳糖苷酶能把无色的化合物X-gal分解
25、成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,X-gal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,-半乳糖苷酶,X-gal显色反应,lacZ的肽互补,1）-肽（lacZ）：,-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。,lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚体,2）受体菌lacZ突变（lacZM15）,受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解X-gal,受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、
26、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a,pUC质粒载体上的lacZ 编码肽与受体菌缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，形成4聚体，从而能分解X-gal，产生蓝色物质。,C端大部分,N端的11-41aa,pUC lacZ,受体菌lacZ,3）载体lacZ与互补,4）互补的插入失活,pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点（MCS）区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。,lacZ,5,3,肽移码突变,lacZ,5,3,肽,不互补,互补,MCS,外源DNA,IPTG的诱导作用,IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌
27、基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ肽都表达。从而互补。,但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽！,IPTG,通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。,MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。,IPTG诱导的结果：,（5）pUC系列载体的优点,更小的分子量，更高的拷贝,pUC18为2686bp，500700拷贝。,选择方便,X-gal显色、抗生素双重直接选择。,克隆便利,具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。,测序方便,M13通用引物,Promega 公司的T载体系列,pGEM-T vector,5.PCR
28、产物克隆载体T 载体,T vector的克隆过程简便！,A,A,T,T,T vector,PCR product,T4 DNA ligase,A,A,（六）其它重要的质粒载体,1.丧失迁移功能的质粒载体,pBR327,在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段,（2）比pBR322有更高的拷贝，平均每个细胞中含有30-45个拷贝。,（1）删除bom识别位点，即便在共存的F质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。保证了基因工程的安全性。,（六）其它质粒载体,2.能在体外转录克隆基因的质粒载体,pGEM-3Z,由pUC派生而来，主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP
29、6。,T7启动子,SP6启动子,MCS,lacZ,Ampr,ori,可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。,如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以体外转录mRNA,外源基因正接反接都可以转录。,pGEM-4Z,与pGEM-3Z相同，只是T7启动子和SP6启动子的位置互换。,pGEM-3Z的特点,MCS与pUC18的完全一样。,3.穿梭质粒载体,（1）穿梭质粒载体的结构,人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同类群的寄主中存活和复制的质粒载体。,（shuttle plasmid vectors）,Yeast复制起点,E.coli复制起点,E.coli选择标记
30、,Yeast选择标记,MCS,大肠杆菌 枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌 酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌 动物细胞穿梭载体,（2）常用的穿梭质粒载体,（3）穿梭载体的优点,也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。,可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。,构建、克隆,表达,E.coli,Animal cell,利用大肠杆菌进行基因克隆,（七）质粒载体的不稳定性,1.质粒稳定遗传必须的两个条件：,（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次,（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中。,有主动分配和随机分配两种假说。,（1）主动分配,天然质粒。,2.质粒分配方式,具
31、有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。,人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。,人工质粒,（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）,（2）随机分配,但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。,在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。,3.分离的不稳定性,（segregation instability）,4.结构的不稳定性,（structural instability）,寄主基因组的插入序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。,IS,dimer,重组,（1）
32、新陈代谢负荷：,5.影响质粒载体稳定性的主要因素,使寄主细胞生长减缓：,质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。,减缓的程度与质粒的分子量成正比。,复制、转录和翻译负荷,丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！,不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，称差度。,（2）质粒载体的拷贝数,低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。,差度（variance）：,是产生无质粒细胞的重要原因。,高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。,质粒载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体，其稳定性比单体差。含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。,野生型E
33、.coli中，质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。,（3）寄主菌的重组体系对质粒载体稳定性的效应,二聚体灾难（dimer catastrophe）：,重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖,蓝白斑筛选,上节内容回顾,其它重要的质粒载体,（1）丧失迁移功能的质粒载体：pBR327,上节内容回顾,（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体：pGEM-3Z,（3）穿梭质粒载体：pYES2,质粒分配方式,（1）主动分配：天然质粒,上节内容回顾,（2）随机分配：人工质粒，在一定条件下会出现质粒丢失的现象。,分离的不稳定性、结构的不稳定
34、性,影响质粒载体稳定性的主要因素,（1）新陈代谢负荷,上节内容回顾,（2）质粒载体的拷贝数,差度（variance）：,（3）寄主菌的重组体系,二聚体灾难（dimer catastrophe）：,低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。高拷贝数的质粒载体差度大，发生丢失的可能性大。,二、噬菌体载体,噬菌体的一般特性,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,上述特性使得噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞2.自主复制
35、繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,分为两种：,1.溶菌周期：,噬菌体的生活周期,感染细菌后，立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。,烈性噬菌体（virulent phage),2.溶源周期：,感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化。,整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。,温和噬菌体（temperate phage),原噬菌体（prophage)：,噬菌体载体,双链噬菌体载体噬菌体单链噬菌体载体M13 cosmid克隆载体,（一）双链噬菌体载体载体,（1）长度
36、为48 502 bp；（2）双链线性DNA；（3）两端5末端带有cos位点，可以环化。,DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。,1.DNA分子的特点,cos位点（cohensive-end site）：,DNA进入菌体后，形成双链环状DNA复制型（RF DNA）,DNA上有至少61个基因，有一半是必需的，与自身的活动有关，功能相近的成簇排列。噬菌体生长的非必需基因，约占1/3，位于尾部合成至阻遏之间的区段（J-N基因），为可替换区。,2.噬菌体的基因组特点,genome(48502bp),3.噬菌体作为构建载体材料的依据,（1）噬菌体是一种温和噬菌体。对大肠杆
37、菌具有很高的感染能力，以原噬菌体的形式长期潜伏在溶原细胞中，容易保存。并且在一定条件下又可转入溶菌生长途径，进行大量增殖。（2）能承载比较大的外源DNA片断。野生型噬菌体头部容许包装DNA分子大小75%105%的DNA片断，约36.451kb.而且DNA上约有20kb的区域对噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA取代。（3）DNA分子上有多种限制性内切酶位点。,4.噬菌体载体的构建,（1）基因组太大（48 502bp）；（2）酶切点太多，它有5个BamH位点，6个Bg位点，5个EcoR位点。（3）野生型只能接纳一定长度的DNA。相当于噬菌体的75-105%，那么能接纳DNA最大为：
38、49kb5%=2.45kb,噬菌体的缺陷：,去除非必需区，建立克隆或替换位点 非必需区内插入选择标记基因 突变某些基因，使它成为安全载体 删除DNA必须区段上常用的限制酶切点 本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点！,4.噬菌体载体的构建,（1）构建过程,噬菌体载体的类型,置换型:,两种类型：,插入型:,噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点，可被外源DNA置换的载体，称为置换型载体。,只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。,（2）人工构建的噬菌体载体有两种类型：,插入型载体（insertion vectors),只具有一个可供外源DNA插入的
39、克隆位点，也有一些有两个位点，但彼此靠近。广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。,1）免疫功能失活型：,插入位点位于合成活性阻遏物区域（cI基因）内cI基因表达，使噬菌体进入溶源状态。,EcoR I,gt10（43 340 bp）,插入导致cI基因失活，载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入的载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。,选择标记,如NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。,2）-半乳糖苷酶失活型载体：,gt10基因组中引入了LacZ序列。,感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用X-gal的显
40、色反应作选择标记。,EcoR I,Charon16A,选择标记:,替换型载体（substitution vectors)p45,可克隆较大的DNA片段（923kb），构建基因组文库,两个MCS，反向重复位于非必需区两端,用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。,选择标记：可取代片断中如果包含LacZ，可用Xgal显色作筛选标记。,1）EMBL4,EMBL4的可置换片断内部还有Sal I酶切位点。,以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。,左臂,可置换区,右臂,EcoR I BamH I Sal I,Sal I BamH I EcoR I,Sal I Sal I,E
41、MBL4,2）Charon40,Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成，片断之间有Hae I 切点。,在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。,载体克隆策略,置换型载体,DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。,5.载体的体外包装,必须利用噬菌体外壳的作用 转导,（2）体外包装的容量限制：,必须在正常野生型容量的75%105%（36-51kb）之间。,既不能超过正常野生型容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%,野生型DNA的必需区是28kb，所以载体的最大克隆容量是。,23kb,（实际上为15kb）。,比一般的质粒载
42、体的容量大的多。,6.DNA载体的优点,用在真核生物基因组文库的建立。,Sau3A,BamHI,上节内容回顾,双链噬菌体载体载体,cos位点,上节内容回顾,双链噬菌体载体载体,插入型载体（insertion vectors),1）免疫功能失活型：,EcoR I,gt10（43 340 bp）,上节内容回顾,2）-半乳糖苷酶失活型载体：,EcoR I,Charon16A,替换型载体（substitution vectors)p45,可克隆较大的DNA片段（923kb），构建基因组文库,上节内容回顾,（2）体外包装的容量限制：,必须在正常野生型容量的75%105%（36-51kb）之间。,野生型D
43、NA的必需区是28kb，所以载体的最大克隆容量是23kb。,上节内容回顾,（二）单链噬菌体载体,M13、f1、fd 噬菌体,单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：,M13 噬菌体,（3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。,（4）不存在包装限制（噬菌体颗粒大小，是受DNA多寡制约）,（5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的 单链分子，便于作探针或测序。,（2）复制型（RF）是双链环状DNA。,（1）+DNA。（ssDNA）,1.单链DNA噬菌体的特点,2.M13 噬菌体,M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。,（1）寄主,2.M13 噬菌体,RF d
44、sDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。,成熟的噬菌体里只包装有+DNA，也容易提取。,M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。,6407 bp。,（2）DNA长度,（3）DNA提纯,（1）寄主,M13通过雄性细菌的F性菌毛注入其+DNA,近200个 RF DNA,每细胞每世代放出约1000个子代噬菌体颗粒！不导致溶菌！,（4）M13的生活周期,M13的包装过程：,RF dsDNA指导合成的+DNA,M13基因V编码单链DNA结合蛋白,DNA-蛋白质复合物,转移到寄主的细胞膜,M13外壳蛋白,基因V蛋白脱落,+DNA,溢出细胞膜,包装,（5）没有包装限制,丝杆噬菌体
45、（如M13或fd）不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，并同时完成毒粒的组装。,虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/23/4）,3.M13载体的构建：,M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。,（1）克隆区域的选定,基因间隔区（intergenic region,IG区）,M13,J.Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。,3.M13载体的构建：,（1）克隆区域的选定,IG区内只有一个 BsuI 切点。,其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。,酶切位点,M13基因组
46、中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。,基因间隔区（intergenic region,IG区）,在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ（-肽序列)。利用-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。,（2）加入选择标记及克隆位点,在IG区内加入-肽序列及克隆位点,第一个M13载体：M13mp1：,M13 RF,BsuI不完全消化,各种长度的线性片断,（其中应有只在IG上切开的线性全长M13）,E.coli lac基因的HindII片断（lacI、lacP、lacO、lacZ）,连接,M13mp1,JM101宿主,只有在IG区插入lacZ才能存
47、活并在X-gal上出现互补的蓝噬菌斑,与pUC18相同,M13mp18的多克隆位点,M13mpn n代表系列数字,4.M13系列载体的优点,（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段,（2）X-gal显色反应，可供直接选择,（3）无包装限制，克隆能力大,（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链,子代M13噬菌体中包含的是单链+DNA。构建成对的M13载体，多克隆位点排列相反,M13 RF,+,-,+,-,+,-,外源DNA,转染E.coli,成熟的子代M13中,+,+,插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降,实际克隆能力小于1500bp。,虽无包装限制，并非无限包装！,5.M13载体的缺点,主要应用
48、于克隆和分离单链外源DNA片断。,6.M13载体的应用,（一）黏粒载体（柯斯载体,cosmid）,三、噬菌体质粒杂合载体,1978年J.Collins和B.Hohn等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid）,DNA：,5-7kb,（1）大小,（2）组成,复制起点 抗性标记基因多克隆位点,cos序列和包装相关序列,pBR322：,pHC79由pBR322质粒DNA与噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成。,具有噬菌体的特性：,（3）cosmid vector的特点,提供了体外包装必须的cos位点。所以克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体
49、颗粒。但是由于cosmid vector不含有 噬菌体溶菌、溶源生长途径和DNA复制系统，所以不会产生子代噬菌体。,具有质粒载体的特性：,大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。,有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。,方便的选择：,高容量的克隆能力，选择性强：,45kb（最少不能低于30kb）。不带外源DNA片段的载体不能被包装,51kb-5kb45kb,（3）cosmid vector的特点,柯斯载体：5-7kb,（4）部分cosmid vector,应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组DNA技术。,（5）柯斯克隆（cosmid cloning）,用特定
50、的核酸内切酶消化真核生物DNA。,用同样的内切酶消化cosmid载体。,产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点、长度40kb左右的真核DNA与载体的连接物。,连接,两个cos位点之间，必须保持38-45kb的DNA，Ter体系才能识别。识别cos位点，切割合适长度的杂种DNA连接物，并包装入噬菌体头部。,注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，并按质粒的方式复制。,感染大肠杆菌,Ter体系识别并切割,感染大肠杆菌产生噬菌斑 OR 抗性菌落？,载体片断自我连接。,外源DNA片断自我连接。,多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体。,（6）cosmid载体克隆的缺点,用碱性磷酸酶
