《基因工程-32大肠杆菌克隆载体.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程-32大肠杆菌克隆载体.ppt（79页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第三章第二部分 大肠杆菌的克隆载体,Cloning Vectors for E.coli,所有克隆质粒中，最多的一类是以大肠杆菌为宿主的。因为：过去50年内，这种细菌在基础研究中一直扮演着中心角色；已积累大量有关大肠杆菌的微生物学、生物化学和遗传学知识；事实上所有关于基因结构和功能的基础研究都是以大肠杆菌为材料而开展的。,3.1 基于大肠杆菌质粒的克隆载体,基因克隆领域最得到广泛应用的也是最简单的，是那些以大肠杆菌质粒为基础而构建的克隆载体。可用于大肠杆菌的有很多不同的质粒载体，其中有很大一部分是由商业公司提供的。他们开发的载体既易于纯化，又结合一些想要的特性，如高的转化效率、方便的转化和重组
2、的筛选标志以及克隆相当大的DNA片段(高达8kb)的能力。如：pBR322。pBR322是最早被构建的质粒，至今仍被广泛使用。,3.1.1 质粒克隆载体的命名法,“pBR322”这个名字符合载体命名法的标准规则：“p”说明它是一个质粒；“BR表示最初构建它的实验室(BR代表了两个构建人的名字：Bolivar和Rodriguez)。“322把该质粒和该实验室构建的其他质粒区分开来(另外还有pBR325，pBR327，pBR328,3.1.2 pBR322的一些有用特性,从pBR322的遗传图谱和物理图谱(图6-1)可以看出为什么它能是一个如此受欢迎的克隆载体？第一个优点在于它的大小 第2章里提到
3、，作为一个克隆载体它的大小应该小于10kb，否则在提纯它的时候很容易导致DNA断裂。pBR322只有4 363bp，意味着可以很容易纯化质粒本身及其所携带的重组DNA分子。即使添加上6kb的DNA链，重组的pBR322的大小仍在可操作的范围内。,第二个优点是拥有两套抗生素耐药性基因两个耐药性基因(氨苄青霉素耐药性和四环素耐药性基因)都可作为含有该质粒的筛选标志，而且每个抗性基因内都拥有一个限制性单酶切位点，这在克隆实验中非常有用。用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及Hind等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会导致四环素抗性基因失活。这意
4、味着pBR322支持很多种不同黏性末端的DNA片段的导入。,第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数 通常在被转化过的大肠杆菌中有大约15个pBR322质粒分子；在蛋白质合成抑制剂(如氯霉素)的存在下，通过质粒扩增，拷贝数可以增加到1 000-3 000。这样，通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组过的pBR322质粒分子。,3.1.3 pBR322的家谱,pBR322作为一个克隆载体的方便性决非偶然，它在被设计时就定好了要拥有这些特点。构建pBR322的步骤简述如图。它的构建是一件曲折而艰巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技术。pBR322实际上由3个在自然界存在的天然质粒拼接而成。,3.1.
5、4 其他大肠杆菌质粒克隆载体,pBR322质粒是在20世纪70年代后期被构建出来的，第一份描述它的用途的论文在1977发表。从那以后，人们构建了大量其他的质粒克隆载体，它们大多数只是对pBR322作了少量修改。,pBR327一个高拷贝数质粒,pBR327通过从pBR322中移除一个长1 089bp的片段而构建。片段的删除并没有损伤ampR和terR这两个抗性基因，但改变了质粒的复制能力和接合能力。pBR327与pBR322有两点重要的不同(1)pBR327的拷贝数比pBR322更高。每个大肠杆菌中可以存在30-45个质粒分子。当实验的目标是研究被克隆的基因功能的时候，有更高拷贝数的pBR327
6、就更适合于用作载体。拷贝数越高，被克隆的基因在细胞中所产生的效果就越容易被发现。,(2)1 089bp片段的删除，破坏了pBR322的接合能力，使pBR327不能把自己转移到另外一个大肠杆菌细胞中去。这一点对生物防范很重要，避免了粗心的生物学家使重组后的质粒从试管和细菌植株中逸出。相反，pBR322在理论上可以通过结合而进入天然的大肠杆菌细胞中去，虽然事实上pBR322也有一定的安全措施减少这种情况的发生。当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选择pBR327。,pUC8乳糖选择质粒,pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。ampR基因的核酸序列
7、也被改变了，不再包含唯一的限制性酶切位点。所有这些位点被集中到pUC8所携带的lacZ基因中的一小段序列上。pUC8所拥有的3个优点使它成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一。,第一个优点人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产生了一个偶然的突变，使得它在大肠杆菌内的拷贝数达到了500-700（扩增以前的数目）。这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量的目的DNA。第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青霉素和X-gal的琼脂培养基上。而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种抗生素培养基平板。一个用pUC8做载体
8、的克隆实验比选择pBR322和pBR327要节约一半的时间。,第三个优点是pUC8拥有多克隆单酶切位点，这使有两个不同黏性末端的DNA片段(比如一端是被EcoRI酶切过的，另一端是被BamHI酶切过的)可以直接被克隆，而不需求助于加入连接片段的操作。其他的pUC载体，拥有不同的限制性酶切位点，具有更大的灵活性，允许更多种不同的DNA片段被克隆。此外，这些载体中的限制性酶切位点与存在于M13mp 系列载体中的限制性酶切位点一样，可以很方便的进行DNA测序或体外诱变。,pGEM3Z克隆DNA的体外转录,pGEM3Z与pUC载体很相似：都含有ampR和lacZ基因，在后者上有一个限制性酶切位点，而且
9、两个质粒有着差不多完全相同的大小。区别：pGEM3Z多两个短片段，每一个片段都可以充当启动子，黏附RNA聚合酶。外源DNA在限制性酶切位点被导入pGEM3Z载体，在限制性酶切位点的两边分别存在着这两个启动子序列。这就意味着，在试管里同时放入重组后的pGEM3Z质粒和提纯的RNA聚合酶，被克隆的DNA分子会指导合成相应的RNA，发生转录。产生的RNA可用作杂交探针，也可用于研究RNA加工(如内含子如何切除)，或是用于合成蛋白质。,被pGEM3Z和其他同类载体所携带的启动子并不是被大肠杆菌RNA聚合酶识别的标准启动子。实际上这些启动子有的被T7噬菌体编码的RNA聚合酶专一性识别，有的被SP6噬菌体
10、编码的RNA聚合酶专一性识别。当大肠杆菌被其中某种噬菌体侵染时就合成这些RNA聚合酶，用以转录噬菌体基因。之所以在体外转录系统中选择病毒RNA聚合酶，是因为它们有着相当高的酶活，因此噬菌体基因一定能够很快被转录出来，能够在每分钟合成1-2gRNA，比标准的大肠杆菌RNA聚合酶高效得多。,3.2 基于M3噬菌体的克隆载体,对任何克隆载体而言，最基本的要求是能够在宿主细胞内自我复制。质粒载体很容易满足这个要求首先它有一个短的DNA序列能够充当复制起点，并且它复制所需要的酶也可以全部或大部分从宿主细胞获得。精密的构建操作，使最终形成的质粒载体如pBR322成为一个完整而具备功能的复制子。,噬菌体，如
11、M13的复制情况就较为复杂。噬菌体的DNA分子通常带有几个为复制所必需的基因，包括编码噬菌体蛋白外壳的组分的基因和编码噬菌体特有的复制酶的基因。改变或是删除这些必需基因中的任一个，都会损伤或是毁坏噬菌体的复制能力。因此可供改变噬菌体DNA分子的自由度很小，而通常的噬菌体载体与原始分子的差别很小。,以M13噬菌体为例，可以看出构建噬菌体克隆载体的难度。一个正常的M13噬菌体的基因组是6.4kb，为紧紧挤在一起的10个基因所占据，每一个基因对噬菌体的复制都是必需的。在基因间只有一个仅长507bp的短序列，新的DNA必须从这里插入才不会损伤其他基因，还必须保证同样处在这个短序列中的复制起点不被破坏。
12、所以，只有一个很小的空间用于改造M13噬菌体。然而，M13有一个很吸引人的优点：它使人们可以获得单链的被克隆DNA。,3.2.1 M13mp2克隆载体的开发,构建M13克隆载体第一步，是把lacZ基因导入到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl，它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。M13mpl的lacZ基因上不含有任何的限制性酶切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆载体。,M13mp2有一个稍稍改变的lacZ基因(第六个密码子编码天冬氨酰而不是天冬氨
13、酸)，但转染了M13mp2的细胞产生的-半乳糖苷酶仍然有着正常的功能。M13mp2是最简单的M13克隆载体。有EcoRI黏性末端的DNA片段可以插入进克隆位点，重组体可以通过在X-gal培养基上的噬菌斑得到识别。,3.2.2 M13mp7对称的克隆位点,开发M13克隆载体的下一步是在lacZ基因上添加额外的酶切位点。通过在试管中合成一个叫做多接头(polylinker)的寡核苷酸而实现。多接头包含一系列的限制性酶切位点，有一个EcoRI的黏性末端。多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位点上，形成了一个更加复杂的载体，即M13mp7。,M13mp7有4个可能的克隆位点：EcoRI，Ba
14、mHI，SalI和PstI。为了不完全破坏掉lacZ基因，在设计这个多接头时，人们使得读码框在通过多接头后没发生改变。这样，产生的-半乳糖苷酶虽然被改变了序列，但仍然有着正常的功能。,用EcoRI，BamHI，SalI中的任意一种去酶解M13mp7，整个多接头或其一部分会被切掉。在其他DNA存在下，有3种连接可能发生：(1)插入的新DNA，(2)插入的多接头。(3)载体自连。,新DNA的插入会阻碍-半乳糖苷酶的产生，因此重组体在含X-gal的琼脂培养基上产生无色透明的噬菌斑。当插入的片段是多接头时，原来的M13mp7载体又再次形成了，噬茵斑是蓝色的。如果是载体自连，噬菌斑应该是什么颜色?多接头
15、又一次显示其巧妙设计：不管用哪一个内切酶酶解，自连的载体都会连成有功能的lacZ基因，最终形成蓝色的噬菌斑。因此，只有重组体产生无色透明的噬茵斑。,由于携带对称的克隆位点，无论新的DNA是通过BamHI，SalI或PstI中的哪一个酶切位点插入载体，都可以用EcoRI从重组后的分子中切除。,3.2.3 更复杂的M13载体,越精巧的M13载体有更复杂的多接头被插入到lacZ基因中。M13mp8：它是pUC8的对应物。和pUC8一样，它允许插入有不同的两个黏性末端的DNA片段。M13mp8姐妹载体M13mp9有一个相同的多接头，但是多接头的方向相反，这使得它有另外一个优点。当把一个DNA片段克隆进
16、M13mp8后，可以用两种限制性内切酶把它再切下来，然后把它连入M13mp9，那么这片段在载体中就有了相反的方向。,这个特点在DNA测序中很重要，因为核苷酸序列从多接头的末端一直读进插入的DNA片段。通常从测序实验中只能读出约600个碱基，如果插入的DNA超过这个长度，就有一个末端的序列读不出来。一种解决的方法就是把DNA换个方向，再插入到姐妹载体中。用这个新得到的克隆，测序实验就可以得到另一端的序列。,还有其他的M13载体可成对选择使用。与M13mp8/9很相似的有：M13mplO/11；M13mpl8/19；但是它们有不同的多接头，即，有不同的限制性酶切位点。,3.2.4 M13和质粒的杂
17、交载体,尽管M13可以产生单链DNA，这使它显得非常有用，但它有很大一个缺点。用M13作载体时，可以容纳的DNA片段大小非常有限，通常认为100bp是上限，特殊情况下克隆的片段长度可达1kb。为了解决这个问题，人们把M13基因组的一部分和质粒DNA结合在一起，构建了一种新型的载体，叫做噬菌体质粒(plagemids)。,pEMBL8是一个噬菌体质粒：通过把M13基因组中一个1 300bp的片段导入pUC8中而构建。M13在形成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双链DNA变成单链DNA，而被导入的那一段M13 DNA则含有被这种酶识别的信号序列。虽然这段序列从M13的基因组中被分离出来，但功能仍然还
18、在。所以，pEMBL8也可以被转化成单链的DNA，并能以有缺陷的噬菌体颗粒的形式被分泌出来。用作pEMBL8克隆实验的宿主大肠杆菌必须随后被正常的M13噬菌体感染。正常的M13噬菌体是作为辅助噬菌体(helper phage)，提供必要的复制酶和蛋白质外壳。,pEMBL8由于是从pUC8发展来的，同样也有插入多接头的lacZ基因，重组体可以通过在含有X-gal的培养基上的噬菌斑而被鉴定出来。可以用pEMBL8产生长度达到10kb的单链DNA片段，这极大地扩展了M13克隆系统的使用范围。,3.3 基于噬菌体的克隆载体,基于噬菌体构建克隆载体时，必须解决两个难题：(1)噬菌体的DNA分子仅能再增加
19、5，即新增加的DNA长度不能超过3kb。一旦DNA的总长超过了52kb，不能包装进入噬菌体的头部，也就不能形成感染性的病毒颗粒。这严重制约了插入DNA片段的长度，限制了噬菌体载体的使用。(2)噬菌体基因组很大，对于几乎每一种限制性内切酶识别位点都不是单一的。所以，无法按我们的需要去酶切和按顺序重新装成有功能的基因组。,3.3.1 从噬菌体基因组移除部分片段而不损伤其生存能力,发现：一个大的DNA片段可以删除。该片段位于DNA的中部，删除后并不影响噬菌体侵染大肠杆菌的能力。去掉这个非必需片段，可以减小15kb。即，可以在噬菌体包装前加入18kb的外源DNA。这一段非必需片段实际上包含一些基因，它
20、们和噬菌体整合与脱离大肠杆菌染色体相关。删除掉这一部分，噬菌体成为一个非溶源性的噬菌体，进行裂解循环。这样无需诱导就可以形成噬菌斑，这对于一个克隆载体来说本身就是一个理想的特点。,3.3.2 用自然选择来筛选那些缺少酶切位点的噬菌体,即使从噬菌体基因组中移掉那个大片段，对于大多数内切酶来说还是有太多的识别位点。如果仅仅要移除一两个这样的识别位点，我们可以通过体外突变来解决。例如，想要去掉一个EcoRI的位点GAATTC，可以把它突变成GGATTC，不会被EcoRI切开。但是，即使现在，要想改变一个DNA分子上的好几个位点，体外突变仍不是一个有效方法。,实际上，可以用自然选择来选出那些缺少不需要
21、的酶切位点的噬菌体。选用可以产生EcoRI的大肠杆菌做寄主，这样大多数的噬菌体DNA就被酶解掉了，但有少量的幸存者并产生了噬菌斑。这些突变噬菌体缺少一个或者好几个EcoRI识别位点。几个这样的感染循环过后，得到的噬菌体是缺失全部或大多数EcoRI位点的突变体。,3.3.3 插入载体和置换载体,解决包装限制和多酶切位点的问题后，就可以着手开发各种基于噬菌体的克隆载体。最先产生的两类载体:插入载体(insertion)置换载体(替换载体)(replacement),插入载体,插入载体的构建过程：去掉一大段非必需片段，剩下的两段再连接起来。为了顺利地插入新的DNA，一个插入载体必须至少包含一个单酶切
22、位点。插入的DNA片段的长度依赖于删除掉的非必需片段的长度。,两个常用的插入载体：(1)gtl0 可以插入超过8kb的外源DNA。外源DNA通过EcoRI单酶切位点插入cI基因，并使该基因失活，使得重组体的噬菌斑是清澈的而不是混浊的。(2)ZAP 可以插入超过10kb的外源DNA。携带的lacZ基因上有一个多接头，外源基因插入到这个多接头上6个酶切位点中的任何一个，都会使该基因失活，从而使重组体的噬菌斑是无色清澈的而不是蓝色的。,置换载体,一个置换载体有克隆所需限制性内切酶识别的两个位点，而在这两个位点之间的DNA片段将会被外源的DNA所置换。通常被置换的那段DNA（克隆术语中称为填充片段）含
23、有其他的一些限制性酶切位点，可被切成许多小片段，因此在克隆实验中它重新被插入的可能性相当小。置换载体可携带的DNA片段长度通常超过插入载体。重组体的筛选往往基于它的大小：没有重组的载体因为太小而不能被包装进入噬菌体的头部。,两个常用的置换载体：(1)EMBL4 可以携带超过20kb的外源DNA。在填充片段的两边有成对的EcoRI，BamHI和SalI的酶切位点。用这3种酶中的任意一种进行酶切都可以除去填充片段，所以可以支持有不同黏性末端的DNA。重组体的筛选可以基于它的大小，也可以应用Spi表型。,(2)GEM11和GEMl2 都可以携带23kb的外源DNA（接近理论上的最大值）。在填充片段的
24、两边各有一个多接头，含有7个不同的限制性酶切位点。这两个载体多接头略有不同，但最外面的一个都是SfiI酶切位点(GGCCNNNNNGGCC)。这个序列极其罕见，不太可能出现在被克隆的DNA片段中。因此可以用SfiI把克隆后的DNA片段完整地切下来。和EMBL4相似，可以根据大小和Spi表型筛选重组体。,3.3.4 用插入载体或置换载体进行克隆实验,用噬菌体载体进行克隆和用质粒载体相似：限制性酶酶切载体，加入新的DNA，连接混合物，产物分子转染大肠杆菌。这种实验需要把载体通过cos位点由氢键连接，以环状分子形式存在。这种转染的方法在大多数情况下令人满意，但效率不高。如果增加一两步操作，可以获得更
25、多的重组体。,首先，要使用噬菌体载体的线状分子。当线状分子被相应的酶酶切后，便形成了左右两个相互分离的片段。连接被克隆的DNA和载体的左右两个片段，连接的结果可能有好几种不同的排列，其中包含一些由重复序列组成的连环体，重复的单位是：载体的左片段被克隆的DNA载体的右片段。如果被插入的DNA是正确的大小，那么分隔这些重复序列的cos相隔正确的距离，能够用于体外包装。产生重组后的噬菌体可以感染大肠杆菌。用这种方法，经过体外包装，可以获得大量的重组分子。,3.3.5 用黏端质粒对大的DNA片段进行克隆,基于噬菌体的克隆载体中，最复杂的形式是黏端质粒。黏端质粒是噬菌体DNA和大肠杆菌质粒两者的杂交体。
26、设计的基础：把噬菌体DNA装进噬菌体头部的酶，仅仅只需要被包装的分子拥有cos位点就能够发挥作用。在体外包装系统中除了基因组外，任何长度在37kb和52kb之间的DNA分子，只要两端含有cos位点，就能被包装进噬菌体头部。,黏端质粒基本上算是一个携带cos位点的质粒。因为它缺少所有的噬菌体基因且不能产生噬菌斑，因此它需要有其他的筛选标记，如氨苄青霉素耐药性基因，也要有质粒复制起点。采用黏端质粒的克隆实验步骤如下:从单酶切位点切开黏端质粒;加入新的DNA片段(这些片段通常是不完全酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于黏端质粒来说太小了);进行连接反应，形成连环体。,如果插入的DNA大小合适，体外包
27、装系统从cos位点切开连环体，把重组后的黏端质粒包装进成熟的噬菌体颗粒。用这些噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产生噬菌斑，把感染后的大肠杆菌培养在选择性培养基平板上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生长。所有的菌落都是重组体，因为那些没有重组的线性的黏端质粒太小，根本不可能被包装进噬菌体头部。,3.4 载体和其他高容量的载体使基因组文库得以建立,基于噬菌体的载体的主要用途是克隆那些不能被质粒或M13载体所操作的DNA大片段。插入的外源DNA片段：M13载体：不超过3kb 质粒：不超过8kb 置换载体EMBL4：达到20kb 某些黏端质粒：40kb。,这种可以克隆如此之大的DNA片段的能力，使得人们可
28、以建立基因组文库。基因组文库：一套覆盖某个生物体所有DNA的重组体克隆。例如，一个大肠杆菌的基因组文库，包含所有的大肠杆菌基因。据此，可以抽提出任何我们所感兴趣的基因加以研究。基因组文库可以保存很多年，也可以很容易在研究组织间相互传播。,当要建立基因组文库时，面临一个重要的问题：一个基因组文库到底需要多少个克隆?可以用下面的公式计算：N=ln(1-P)ln(1-ab)N指所需要的克隆的个数，P是得到所有基因的可能性，a是插入到载体中去的DNA片段的平均大小，b是基因组的大小。,从几十万个克隆中一个个筛选出感兴趣的基因是不明智的。减少克隆数的方法：方法一：开发能够携带更大DNA片段的克隆载体。细
29、菌人工染色体（BACs）：基于F质粒构建的新载体。F质粒相对较大，由它开发的载体有着比普通质粒载体大很多的容量。BAC能够插入超过300kb的DNA片段，由此使人类基因组文库的克隆数下降到30 000个。,基于噬菌体P1发展而来的载体 P1优于的地方：能够在它的蛋白质外壳中挤进110kb的DNA。基于噬菌体P1设计的黏端质粒可以用于克隆长度从75 kb到100kb的DNA。还有一种载体，结合了P1载体和BAC的特点，称为由P1衍生的人工染色体(P1-derived artificial chromosome，PAC)，同样也拥有超过300kb的容量。,3.5 其他细菌的克隆载体,人们还开发了为其他一些细菌服务的载体。这些载体中，有的只对特定宿主有效的质粒载体；有的是能够在许多宿主中复制的广谱宿主质粒；还有少数几个是从噬菌体开发出来的克隆载体。大多数这些载体的性质和用法都和大肠杆菌的载体很相似。,
