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1、,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库(Genomic library),是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和
2、保存某种生物的全部基因。,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,2)cDNA文库(cDNA library),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA-基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库（部分）,基因
3、文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,基因文库的分类,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中得到目的基因的方法,2、利用PCR技术扩增目的基因,生物体内DNA分子复制的条件,DNA聚合酶的特性,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。,小资料：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。,5，端含磷酸基团,3，端含羟基,3，端,5，端,3,
4、5,5,DNA的复制方向,DNA 分子的热变性原理,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物与两条单链结合,在80100 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性,PCR原理,高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。,PCR 反应的条件,DNA模板；分别与两条模板链相结合的两种引物（引物和引物）；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶；控制温度，但不需解旋酶；需要在一定的缓冲液中进行。,1、PCR的反应步骤,PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个步骤变性、复性和延伸。,循环之前的一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。,PCR的反应过程,第一轮,DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸,2、PCR的反应结果,3、人工合成法：,基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成,
