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1、,DNA重组技术,Gene engineering,原理与实践,Take a donor egg,suck out the nucleus,and hence the DNA,and fuse it with,say,a skin cell from the human being copied.Then,with the help of an electrical current,the reconstituted cell should begin growing into a genetic duplicate.,重组DNA技术的重大突破引发现代生物技术的兴起，并很快诞生了许多生命科学的
2、高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术，包括了一系列分子生物学操作步骤。基因工程(gene engineering)就是有意识地将一个生物体中有价值的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产品。,重组DNA技术是基因工程的核心,DNA重组技术示意图,One basic cloning technique begins with the insertion of a foreign gene into a bacterial plasmid.,Fig.20.1,DNA重组技术,质粒、DNA或RNA提取(Extraction)酶切（Enz
3、yme digest)连接（ligation)转化（transformation)筛选（selection)蛋白表达（Protein expression),第一节 质粒和质粒提取Chapter 1 Plasmid and Plasmid extract,（一）关于质粒（1）质粒的概念,质粒(Plasmid)是双链、闭环DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞染色体外的遗传因子。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶，离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使无它们也可存活。,Chromosomal DNA,Plasmid（已经连接外源DNA),单拷贝质粒（p
4、lasmid）,质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体,染色体,质粒,（2）质粒的复制,紧密控制型(Stringent control)：只在细胞周期的特定阶段进行复制。染色体不复制时,它也不能复制。松驰控制型(Relaxed control)：在细胞周期中随时可以复制,有多拷贝。蛋白质合成抑制剂-氯霉素使细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受抑制。紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制。,（3）质粒的不相容性(Incompatibility),同一复制系统的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中,两种质粒彼此竞争。细胞生长几代后,某个质粒丢失。发酵出发
5、菌株 单质粒,（4）质粒载体,质粒载体是由天然质粒经人工改造而成。与天然质粒相比,质粒载体带有选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和人工合成多克隆位点序列,并去掉了许多非必需序列,使分子量减小,便于基因工程操作。,理想克隆载体的特性,分子量小、多拷贝、松驰控制型具有多种常用的限制性内切酶的单切点能插入较大的外源DNA片段具有容易操作的检测表型。常用质粒载体大小在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。,pBR322old-style general purpose plasmid,4362 bp,以Ampr和Tetr为选择性标记，克
6、隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。,pUC19,2.68kbp,Multiple Cloning Sequence(Polylinker),GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAC,Part of MCS of pUC19 and other plasmids,EcoRI,KpnI,BamHI,Sal I,XbaI,SmaI,SacI,（二）提取质粒DNA的方法,3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。用溶菌酶破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞膜。经溶菌酶和
7、SDS处理后,细菌染色体DNA会缠绕在细胞碎片上,而质粒比细菌染色体DNA小得多，所以3000-5000g离心后，质粒留在上清液中。,用强热或酸、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)两条链不会分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然超螺旋分子,并溶解于液相中。,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。提取质粒时，除超螺旋DNA外，还有其它形式质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就
8、能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA,简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。所以电泳有23条带。,附：试剂配制,1、LB液体培养基(Luria-Bertani)：蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract)5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.0-7.5（有时pH试纸比pH计更可靠），加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌2
9、0分钟。,2、LB固体培养基：每升液体培养基中加10-12g琼脂粉,高压灭菌。问题：如果配制1升LB固体培养基，然后分装到10个三角瓶，何时加琼脂粉？,3、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液,-20保存备用。注意分装 4、溶菌酶溶液：用10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20。问题:溶菌酶的作用是什么?,5、RNA酶A母液 将RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5),15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100加热15分钟,使DNA酶失活。冷却后用
10、1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20。,6、TE缓冲液：10 mmo/L TrisCl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中 问题:(1).如何配制10 mmo/L TrisCl(pH8.0)?(2).TE缓冲液的作用?何种溶液可以代替它?,7、3mol/l NaAc(pH5.2)：50ml水中溶解 NaAc3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4冰箱。,8、溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液可成
11、批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。9、溶液：0.2 mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1 SDS。现用现配10、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Ac 5mol/L。,11、酚：市售酚中含有醌等氧化物可引起磷酸二酯键的断裂，及导致RNA和DNA的交联,应在160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L TrisCl(pH8.0)和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲
12、液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。,12、氯仿:按氯仿:异戊醇24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。,（三）质粒提取步骤,1、细菌的培养和收集 将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50g/ml Amp)中,37培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50g/ml Amp)中,37振荡培养至对数生长后期。,2、质粒DNA少量快速提取,（A）煮沸法
13、 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,12000离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中,涡旋混匀。4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡 3秒钟。5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。6、12000g离心10分钟。7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。8、电泳检查。,（B）碱法,1、1.5ml菌液倒入1.5ml eppendorf管中,12000g离心30秒。2、弃上清,倒置于卫生纸上,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温放
14、置5-10分钟。4、加入新配制的溶液 200l,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,千万不要振荡,冰浴5分钟。5、加入150L预冷的溶液,温和振荡10秒,冰浴5分钟,12000g离心5分钟。6、上清液移入eppendorf管中,加入等体积酚/氯仿(1:1),振荡混匀,12000g离心5分钟。,7、水相移入eppendorf管中,加2倍体积无水乙醇,振荡混匀，-20放置20分钟，4下12000g离心10分钟。8、弃上清,加入1ml 70乙醇,12000g离心5分钟。9、弃上清,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。10、将沉淀溶于20l TE(pH8.0，含20g/ml RNase
15、A)中，储于-20冰箱。注意 1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。,（C）CTAB法,菌液5000rpm离心3分钟，得细胞沉淀；加入STET缓冲液及裂解酶，震荡混匀，室温下放置10分钟；沸水浴45秒，12000rpm离心15分钟，去沉淀留上清；加入RNA酶，65水浴15分钟；加入CTAB，12000rpm离心5分钟；用1.2M的NaCl悬浮；用2倍无水乙醇沉淀DNA；12000rpm离心10分钟；75%乙醇洗涤一次；12
16、000rpm离心5分钟；再用75%乙醇洗涤一次；干燥后加入TE，-20保存。,CTAB法的优缺点,优点：避免使用氯仿等腐蚀性试剂缺点：得率较低,3、质粒DNA的大量提取,（A）碱法 1、取对数生长后期菌液250ml，5000g离心10分钟,弃上清,离心管倒置使上清流尽。2、细菌沉淀重悬浮于5ml溶液I中。3、加入10ml新配制的溶液II,缓缓地颠倒离心管数次,以混匀内容物,冰浴10分钟。4、加10ml用冰预冷的溶液III,摇匀离心管,冰置15分钟,此时形成白色絮状沉淀。,5、5000g离心15分钟。6、取上清,加入RNA酶A(10mg/ml),37水浴20分钟。7、加入等体积的饱和酚/氯仿,振
17、荡混匀,12000g离心10分钟。8、取上层水相,加入等体积氯仿,振荡混匀,12000g离心10分钟。9、取上层水相,用70%冷乙醇洗涤，12000g离心5分钟。10、倒置离心管，风干沉淀，溶于500ml TE或水中。,注意,1.提取过程中应尽量保持低温。2.加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。3.由于RNA酶A中常有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,应先对该酶液进行热处理(80 1小时),使DNA酶失活。,(B)煮沸法,将培养液倒入eppendorf管中,12000g离心30秒。弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。将菌体沉淀悬浮于 STET溶液中，涡旋混匀。加入新配
18、制的溶菌酶溶液（10mg/ml），涡旋震荡5秒钟。将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。12000g离心10分钟。用灭菌牙签剔除eppendorf管中的细菌碎片。取20ul进行电泳检查。,第二节 DNA酶切及凝胶电泳,（1）酶切和酶切图谱（2）琼脂糖凝胶电泳（A）电泳所用试剂（B）电泳步骤,（1）酶切和酶切图谱,DNA或RNA.测其浓度缓冲液（含Mg2+)10双蒸水酶（含甘油）37水浴保温2-3小时 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都影响限制性内切酶的活性。,Manipulating Genes,-Cutting up the DNA,Section of DNA
19、 molecule,Restriction Endonuclease,Manipulating Genes,-Digesting the Plasmid DNA,Digest with EcoR1,Manipulating Genes,-The Resulting Recombinant DNA,G,G,C,T,T,A,A,A,A,T,T,C,C,G,T,T,A,A,G,A,A,T,T,C,Donor Gene Inserted,限制性内切酶,已经发现和鉴定了200多种,EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶,酶切图谱,DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的
20、物理图谱，它由一系列限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。通过综合分析多种酶单切、双切所得到的限制性片段来确定各种酶的酶切位点及相对位置。,Restriction fragment analysis indirectly detects certain differences in DNA nucleotide sequences.After treating long DNA molecules with a restriction enzyme,the fragments can be separated by size via gel electrophoresis.This
21、produces a series of bands that are characteristic of the starting molecule and that restriction enzyme.,Restriction fragment analysis detects DNA differences that affect restriction sites,We can use restriction fragment analysis to compare two different DNA molecules representing,for example,differ
22、ent alleles.Because the two alleles must differ slightly in DNA sequence,they may differ in one or more restriction sites.If they do differ in restriction sites,each will produce different-sized fragments when digested by the same restriction enzyme.In gel electrophoresis,the restriction fragments f
23、rom the two alleles will produce different band patterns,allowing us to distinguish the two alleles.,Copyright 2002 Pearson Education,Inc.,publishing as Benjamin Cummings,Restriction fragment analysis is sensitive enough to distinguish between two alleles of a gene that differ by only base pair in a
24、 restriction site.,Fig.20.9,已知序列酶切图谱制作,根据多个酶切片段的长度，推导酶切位点DNAstar等 软件,（2）琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶分离DNA长度从200bp至近50kb片段。实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳进行DNA电泳。聚丙烯酰胺凝胶（PAGE)可分离较小片段，多采用垂直装置进行蛋白质或DNA电泳。,迁移速率由下列因素决定,DNA的分子大小琼脂糖浓度DNA分子的构象电源电压嵌入染料的存在离子强度影响,（A）琼脂糖电泳所用试剂,TBE 缓冲液(5)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定容至1000m
25、l。TAE缓冲液 上样缓冲液(6)：0.25%溴酚蓝(指示剂)，40%(w/v)蔗糖水溶液（增加比重）。,溴化乙锭(EB)插入DNA双链之间，在紫外照射下呈现亮色溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。使用时溴化乙锭(EB)直接加入琼脂糖凝胶或稀释后染色。,电泳设备琼脂糖凝胶电泳系统水平凝胶电泳系统紫外分析仪凝胶成像系统,（B）电泳步骤,制胶：0.71.0琼脂糖加双蒸水，微波炉中加热融化，冷却至60度，加EB,倒平板加样打开电源进行电泳拍照Photoshop处理图片,pBS(-),5kb,2kb,1.5kb,1kb,0.75kb,琼脂糖凝胶电
26、泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动,酶切和电泳方法,For linear DNA molecules,separation depends mainly on size(length of fragment)with longer fragments migrating less along the gel.,思考题 1.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,你认为可能是什么原因？2.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？,第三节 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化,受体细胞经处理后(如电击法,CaCl2 等法),细胞膜通透性发生暂时性改变,成为
27、允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Component cells)。转化(Transformation)是将外源DNA引入受体细胞,使之获得新的遗传性状。,一、感受态细胞的制备(CaCl2 法),受体菌的培养 挑取新活化的E.coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右。,1、菌液冰浴10分钟,4下3000g离心10分钟。2、弃上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰置20分钟,
28、4下3000g离心10分钟。3、弃上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻悬细胞,冰置5分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成50100l的小份,-70可保存半年。感受态细胞的制备关键是什么？,二、转化(Transformation),将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状,Transfection Methods,转染,电脉冲穿孔法,不需要预先诱导感受态细胞,操作简单转化效率高109 转化子/微克闭环DNA 而氯化钙为106 108细胞死亡率增高需要成套的设备,转化(Transformation)步骤（热击法）,1、从-70冰箱中取100
29、l感受态细胞悬液,冰上解冻。2、加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10l),轻轻摇匀,冰置30分钟。3、42水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却5分钟。,4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。5、将上述菌液4000g离心，弃上清，留200l 涂布于Amp筛选LB平板上,正面向上放置半小时,待菌液被培养基吸收后倒置培养皿,37培养过夜。,Thanks for your patience!,第四节 重组质粒的连接、转化及筛选,北京化工大学生命科学与技术学院 田平芳,一、连接是
30、DNA重组的关键,（一）、连接反应,1、将已经酶切线性化的载体DNA与等摩尔(可稍多)的外源DNA片段（相同酶消化）混匀，加适量双蒸水。2、65保温15分钟。3、室温3分钟。4、加入T4 DNA ligase buffer,T4 DNA ligase,混匀,16保温过夜。,载体自连怎么办？-去磷酸化Alkaline Phosphatase Action,Alkaline Phosphatase Action,Two nicks remainWill be repaired inbacterial cell follow-ing transformation,（二）载体和目的基因连接方式,按照切
31、口形状划分：平末端连接粘末端连接按照限制酶数目划分：单切点双酶切,限制性内切酶的剪切方式,平末端连接难于粘末端连接,单酶切载体和目的基因,多用于筛选文库 筛选文库的流程造成双向插入，故不适合基因表达,定向克隆（Directional Cloning）,H B,H B,H,B,H:Hind III B:BamH I,定向克隆（Directional Cloning）,Digest plasmid and target DNA with two different restriction enzymesHind III and BamHIEnds are not compatible（末端不匹配）
32、Plasmid wont re-circularize unless target DNA has inserted(质粒不会自连）双酶切应当注意的问题？,二、转化,三、筛选,本课介绍载体质粒pBS,转化受体菌为E.coli DH5菌株。由于pBS上带有Amp抗性基因 和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与-互补现象筛选相结合的方法。,蓝白筛选的原理：-互补,lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。由-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被
33、IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去-互补能力,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。,互补,载体 Plac 受IPTG诱导 半乳糖苷酶氨基端片段 宿主细胞 互补 缺陷型半乳糖苷酶 geo+X-gal 蓝色菌落 插入片段 使载体不能表达半乳糖苷酶氨基端片段 白色菌落,质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大
34、肠杆菌形成蓝色克隆。在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆,利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒,质粒还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。,Blue-White Screening,X-Gal,Blue productand colony,b-galactosidase(lacZ),(colorless),White colony,no cleavage of X-gal,non-functional b-gal,X-Gal=5-bromo-4-chloro3-indolyl-b-D-galactopyranoside,重组质粒筛选实验步骤,1
35、、取转化原液100l用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上。2、倒置平板37培养,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。3、放于4数小时,使显色完全。不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在Amp平板上成活。带有pBS载体的转化子由于具有-半乳糖苷酶活性,在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。,附：含Amp、X-gal和IPTG的LB平板制备,用微波炉溶化100ml LB固体培养基,待温度降至50时,分别加入50ul,100ul,20ul 的Amp、X-gal和IPTG，旋转混匀，倒平板
36、凝固后待用。从-70低温冰箱中取出感受态细胞DH5，室温下稍稍解冻,向其中加入连接混合液，混匀后冰浴30分；42热击90秒或37 5分钟，取出,立即置冰上5分钟；加入不含氨苄（Amp）的LB培养基，混匀后37培养45分钟，使细菌恢复正常生长状态；取出后每分3000转离心5分钟，涂板后37培养过夜。,思考题,1.在用质粒载体进行外源DNA片段克隆时主要应考虑哪些因素？2.利用互补现象筛选带有插入片段的重组克隆的原理是什么？,粘性末端,质粒,目的基因,粘性末端,匹配的粘性末端,酶切后的目的基因片段,接(连接),连接后的重组质粒DNA分子,大肠杆菌,转(转化),染色体,真好玩!,(筛选),分解抗生素
37、的酶,含抗生素的培养基,还活着!,玩完啦!,大肠杆菌,大肠杆菌,大量扩增,提取大量质粒,酶切鉴定,Outline of DNA recombination techniques,您已掌握DNA重组的主要步骤,获得目的基因和载体用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端连接酶将目的基因装与载体转化细菌筛选具有抗药性克隆,第五节 基因组DNA的提取和酶切,基因组DNA的制备基因组DNA的检测,北京化工大学生命科学与技术学院 田平芳,细胞内总DNA的提取,细胞内总DNA的提取分离程序,问题：DNA操作中离心的转速如何确定？,30005000？分离菌体10000？分离核酸,（一）基因组DNA的提取,利用基
38、因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组大分子DNA沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。,细菌基因组DNA的制备,培养细菌,5000rpm离心10分钟,去上清液。加9.5ml TE悬浮沉淀,并加0.5ml 10%SDS,50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K,混匀,37保温1小时。加1.5ml 5mol/L NaCl,混匀。加1.5ml CTAB/NaCl溶液,混匀,65保温20分。用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10
39、分钟,上清液移至离心管。用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中。加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA。用玻棒捞出DNA,70%乙醇漂洗,吸干,溶解于1ml TE,-20保存。,（二）基因组DNA的检测,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。1.DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260/OD280 比值,明确DNA的含量和质量。2.取2-5l 在0.7%agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。3.取2g DNA,用10单位(U)Hind酶切过夜,0.7%agarose胶上
40、电泳,检测能否完全酶解(做RFLP,DNA必须完全酶解)。,如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小分子DNA多,影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。（2）酚:氯仿抽提,去除蛋白质和多糖。（3）Sepharose柱过滤,去除酚类、多糖和小分子DNA。（4）CsCl梯度离心,去除杂质,分离大片段DNA(可用作文库构建)。,紫外分光光度计测定DNA纯度和浓度,基因组完全酶切,基因组酶切不彻底,思考题,1.提取基因组DNA的目的之一是构建文库，为什么构建DNA文库时,一定要用大分子DNA？2.如何检测和保证DNA的质量？,第六节 RNA提取和cDN
41、A合成,北京化工大学生命科学与技术学院 田平芳,一、RNA提取细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍、热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速提取高质量的总RNA。,异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法1.取100mg细胞组织.2.加入500ul变性裂解液（异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌氨酸钠、-巯基乙醇），冰浴匀浆，充分裂解细胞.3.依次加入50ul 乙酸钠（pH4.0）、500ul水饱和酚、100ul氯仿：异戊醇(49：1)，用力振荡15秒，冰浴15分.4.4，12000r/min，离心20min.5.上清加等体积异丙醇，-20过夜.6.4，12000r/min，离心20min.7
42、.沉淀溶于300ul变性裂解液中，加入等体积异丙醇，混匀，-20放置2h以上。8.4，12000r/min，离心20min.9.沉淀用75%乙醇，4，12000r/min，离心20min洗盐10.4干燥，溶于20ul三蒸水中。,动植物总RNA提取-Trizol法,用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。1、将组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。3、取上层水相于一新的离心
43、管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。,4、弃上清，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加75%乙醇，混匀，4下7500g离心5分钟。5、小心弃去上清，室温或真空干燥5-10分钟，不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70注意事项：1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。2、加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。,RNA制备注意事项:
44、,防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,是实验成败的关键全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用玻璃器皿需在烘箱180烘烤6小时以上。凡不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC，PC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。,纯mRNA制备：分离的总RNA可利用mRNA 3末端含有多聚(A)+的特点,当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两
45、次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70可保存一年。,二、cDNA合成 从真核生物组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增,即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题,纯mRNA制备 分离的总RNA可利用mRNA 3末端含有多聚(A)+的特点,当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,
46、然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。,Complementary DNA is DNA made in vitro using mRNA as a template and the enzyme reverse transcriptase.,基因文库构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在问题费时费事 内含子序列,以mRNA为模板，以短的寡核苷酸（oligo(
47、dT)）分子作引物，加入dATP,dTTP,dGTP和dCTP,oligo(dT)与mRNA分子的多聚A（polyA）尾巴碱基配对，在逆转录酶作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。接着，在大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段的作用下，再以第一条DNA为模板，人工合成另一条互补的DNA子链。这种经过mRNA反转录人工合成的双链DNA被称为互补DNA（cDNA）。,cDNA合成,mRNA提取，先合成第一链再合成第二链生物公司提供各种各样的cDNA合成试剂盒。cDNA文库 在细胞分化的不同阶段，根据代谢反应的特殊需要，特异性地转录产生编码特殊蛋白的mRNA。因此，用cDNA方法获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因。,基因组与基因组学,基因组研究 功能基因组学发现新基因定位克隆RNA转录分析,
