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1、第九章 DNA序列分析,DNA双螺旋结构解明之后，研究基因组中每一个基因的作用就成为了生物科学工作者的主要课题。为此，首先必须设法知道目的基因的核苷酸排列顺序，即基因测序。,DNA测序方法：,Maxam-Gilbert 化学降解法 双脱氧链终止法（Sanger酶学法）,第一节 Maxam-Gilbert 化学降解法,1977年，A.M.Maxam 和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法，由于该方法是用特定化学试剂修饰不同碱基，并在相应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的，故称之为Maxam-Gilbert 化学降解法。,一、基本原理,将待测DNA片段的5端磷酸基团作放射性标记，
2、再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列5端被标记的长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。,直接或间接特异性识别4种碱基生成其始于固定起点和终止于特定碱基的一组核苷酸片段特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处（5或3）打断磷酸二酯键,二、化学降解测序法的基本步骤,对待测DNA片段的5端磷酸基团作放射性标记；用化学修饰剂修饰特定碱基；凝胶电泳分离和放射自显影及读序。,第二节 Sanger双脱氧链终止法,一、基本原理,双脱氧核苷酸（dd
3、NTP）分子的脱氧核糖的3位置的羟基缺失，当它与正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA聚合酶的作用下，虽然它也能参与DNA合成，但由于其3位置的羟基缺失，使其下面的核苷酸的5磷酸基无法与之结合。也就是说，一旦双脱氧核苷酸整和到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。,以待测单链或双链DNA为模板，使用能与DNA模板结合的一段寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的催化作用下合成新的DNA链。正常情况下的DNA聚合酶催化反应在其反应体系中包含4种脱氧核苷酸，合成与模板DNA互补的新链。当向该反应体系中加入一种双脱氧核苷酸后，在DNA合成过程中ddNTP将与相应的dNTP竞争掺入到新合
4、成的DNA互补链中。如果dNTP掺入其中，则DNA互补链将继续延伸下去；而如果ddNTP 掺入其中，DNA互补链则到此终止。,二、序列分析的基本步骤,1、模板制备和引物设计,模板：单链或双链DNA，必须保证足够的浓度引物：18-22nt，55-60，尽量避免3个以上碱基重复，尽量减少发夹结构形成的可能性。,多数情况采用通用引物测序。,2、经典测序方法的反应步骤,模板变性 退火 标记掺入标记：-32PdATP、-33PdATP、-35PdATP 末端标记：-32PrATP 延伸 电泳分析和数据读取,三、序列分析的工作模式,手动测序,缺点：工作强度大，操作人员要求技能娴熟。测序长度有限。,PCR测序,全自动测序,用4种不同的罗丹明荧光染料分别标记4种双脱氧核苷酸。,第三节 DNA片段序列测定的策略,一次测序反应一般可读出500-800bp，若待测序的DNA片段较大，则需从多处不同的位置引导测序反应。,通用引物指导未知序列的测定 引物步移 随机克隆测序 缺失克隆测序,3.缺失克隆测序,随机克隆测序详细过程：,
