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1、第五节 基因工程菌的稳定性,基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。质粒不稳定可分为：分裂不稳定 结构不稳定,分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。这种菌与带质粒的菌相比具有生长优势，因而减少了基因表达的产率。,一、质粒不稳定产生的原因工程菌的质粒不稳定常见的是分裂不稳定，它主要与两个因素有关：含质粒菌产生不含质粒子代菌的 频率；这两种菌的比生长速率差异的大小。,对同一工程菌，控制不同的比生长速率可改变质粒的拷贝数：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，增加工程菌中质粒拷贝数可提高质粒稳定性
2、；,高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但大量外源质粒的存在使含质粒菌的比生长速率明显降低，而一但不含质粒菌产生，便成为优势菌株，对质粒的稳定性不利。,菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高比生长速率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。,生长速率/h,0.2,0.4,质粒拷贝数,1,0.5,10,950,40,0,-半乳糖苷酶工程菌JM103(pUC8)的连续养,3,Betenbaugh将质粒复制必需的RepA蛋白克隆在PR启动子的下游，质粒拷贝数受温度诱导，诱导后质粒浓度从60gg细胞增加到l,900gg细胞，从而增加了基因拷贝数，使外源基因的表达明显增加。,但是在高拷贝质粒菌中
3、质粒拷贝数增加与产物增加往往不成正比，这可能是由于含高拷贝质粒的菌中，蛋白合成的限速步骤是转录和翻译，基因的大量复制加重了转录和翻译的负担，使其速度减慢。,质粒稳定性的分析,样品,不含抗性标记抗生素 平 板 培 养基,10-12h,100个菌落,含抗性标记抗生素平 板 培 养 基,10-12h,统计生长菌落数,重复三次,计算比值,该比值反应了质粒的稳定性(稳定性 stability，ST),稀释,二、提高质粒稳定性的方法,为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法（分阶段控制培养）：先使菌体生长到一定密度；再诱导外源基因的表达选择合适的宿主菌与合适的载体,在培养基中加入选择性压力（抗菌素）
4、抑制质粒丢失菌的生长，是提高质粒稳定性的常用方法。调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度可使工程菌生长速率具有优势。,有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释速率，都可以提高质粒稳定性。,例子：对表达干扰素a的大扬杆菌W3110(pEC901)在不同比生长速率下的质粒稳定性随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰素的比效价也明显增大。,提高质粒稳定性的方法？,选择合适的宿主菌与载体增加质粒的拷贝数分两阶段培养工程菌选择压力改变发酵条件改变细胞的稀释速率改变培养方式（固定化培养）,第六节 基因工程
5、菌生长代谢的特点,菌体的生长通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率有重要意义。,大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度也反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变（营养成分、dO2、补料或稀释速率、温度等），会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。,一、菌体的生长与能量的关系,碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生代谢副产物乙酸，导致培养
6、基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用,分批培养中选择不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等都能在一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它产生的抑制作用。,Han等发现在基本培养基中加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。甲硫氨酸提高了菌体的有氧代谢能力；而酵母提取物在提高比生长速率的同时，能使菌体减少对葡萄糖的摄取，从而减少乙酸的产生。,通过基因构建解决Beiley报道，在大肠杆菌中克隆具有携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率，减少乙酸的产生。Bauer采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止了乙酰辅酶A转化为乙
7、酸，提高蛋白的产量。,减少发酵过程中乙酸副产物的影响途径？pH值发酵控制（碳源、控制无机磷的浓度、补料速度、稀释速率、提高溶氧）培养基中添加物质（甲硫氨酸和酵母提取物）基因工程（携带氧能力的VHB蛋白基因、使用磷酸乙酰化酶缺陷株）改变培养方式-透析培养,二、菌体生长与前体供应的关系,在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，加剧了这些成分的不足，特别是工程菌诱导后，外源基因的大量表达，引起工程菌比生长速率降低，甚至生长停滞。,质粒存在对菌体代谢的影响：Birnbaun发现，中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌
8、中，一些酶与前体合成有关的酶的相对水平增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，菌体比生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用，引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。,“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为“魔点”的ppGpp的结果。ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延伸过程减少转录。,它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合
9、酶与PL启动子专一识别反应来减少转录。,第七节 基因工程菌发酵,基因工程菌的培养过程包括:摇瓶操作了解基因工程菌生长的基础条件,如温度、pH、培养基各种组分、碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响;培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。,菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物发酵流程图,基因工程药物生产过程,上游构建（基因工程）,发酵生产（发酵工程）,纯化制备,一、基因工程菌的培养方式,基因工程菌的培养方式：1、补料分批培养2、连续培养3、透析培养 4、固定化培养,1、补料分批培养,补料分批培养是将种子接入发酵反
10、应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。溶氧控制、流加补料,2、连续培养,将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定的稀释率进行不间断的培养。,3、透析培养,利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。传统生产外源蛋白的发酵方法，由于乙酸等代谢副产物的过高积累而限制工程菌的生长及外源基因的表达，而透析培养解决了上述问题。,4、固定化培养,有利于提高质粒的稳定性，便于进行连续培养，特别是对于分泌型菌更为有利。,二、基因工程菌的发酵工艺,基因工程菌的发酵与传统
11、的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。,工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。,影响发酵的主要因素：培养基成分的影响 接种量的影响 温度的影响 溶解氧的影响 诱导时机的影响 pH的影响,培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。还有无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。,
12、不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但以甘油为碳源的菌体收获量较大，而以葡萄糖为碳源的菌体产生的副产品较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。使用乳糖为碳源较为有利，乳糖对lac启动子起诱导作用。,在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。,在生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的合成、糖代谢、细胞呼吸及ATP浓度的控制中，过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生长和氧消耗。研究表明，在低磷浓度下，尽管最大菌体浓度较低，但产物产
13、率及产物浓度都最高。,启动子只有在低磷酸盐时才被启动，因此必须控制磷酸盐的浓度，使细菌生长到一定密度，磷酸盐被消耗至低浓度时，目的蛋白才被表达。起始磷酸盐浓度应控制在0.015molL左右，浓度低影响细菌生长，浓度高则外源基因不表达。,接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。,接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。5%、10%、15%？,温度的影响,温度对基因表达的调控
14、作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节物质的合成等水平上。温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。,如大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄糖阻遏，而且还受温度的调控。青霉素酰化酶基因工程菌-大肠杆菌A56(pPA22)，合成青霉素酰化酶的量从37起随着温度降低而逐渐增加，至20-22达到高峰，在18和16合成酶量又逐渐下降，这是由于在18和16培养时菌体生长较慢，影响所合成酶的总量。,适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。温度还影响蛋白质的活性和
15、包含体的形成。,温度高(37)时，由于细菌的热体克(hot-skock)系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，使表达产物降解。因此，表达量低于在30时发酵的产量。重组人生长激素在不同的温度培养时，还影响产物的表达形式：30培养时是可溶的，在37培养时则形成包含体。,溶解氧的影响,对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。,发酵时，随dO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高的dO2值，才能提高工程菌的生长，利于外
16、源蛋白产物的形成。,采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,诱导时机的影响,对于PL启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（clts857），在2830 0C下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录；当温度升高42 时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的转录翻译效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。,在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109个/mL(OD600为2.5)为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。,pH的影响,pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效
17、表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。,采取两段培养工艺时，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,细胞生长期的最佳pH在6.87.4左右，外源蛋白表达的最佳pH为6.06.5。,总之,最佳化的工艺是获得:最快生产周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等指标的保障。,工艺最佳化需对不同的菌种做大量的试验，取得重复性好的准确数据后，模拟发酵代谢曲线，预测放大值，更合理地设计最佳工艺条件。,三、基因工程菌的培养设备,应用发酵罐大规模培养基因工程菌。不同于微生物发酵，微生物发酵目的是
18、为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物，需要获得高浓度的受体细胞和基因的高表达产物。对培养设备和控制条件都有严格的要求。,发酵罐的组成有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。,基因工程菌在发酵培养过程中要求环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。,对发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件，培养过程不得污染，保证纯菌培养，培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等。,第三章 基因工程制药思考题（3）,1、质粒的概念；2、质粒不稳定的原因及提高质粒稳定性的方法是有哪些？3、如何进行质粒稳定性分析？4、列出工程菌的发酵流程；,5、如何减少代谢副产物乙酸对工程菌的影响？6、基因工程菌在发酵过程中的主要影响因素有哪些？7、接种量的定义及接种量对外源基因表达的影响是什么？,
