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1、2023/10/11,1,第二章 基因工程技术制药,2023/10/11,2,一、概 述-几个概念,基因工程技术？,是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。,2023/10/11,3,基因工程药物？,系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物。,一、概 述-几个概念,2023/10/
2、11,4,基因工程药物上游阶段？,主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。,一、概 述-几个概念,2023/10/11,5,基因工程药物下游阶段？,从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。,一、概 述-几
3、个概念,2023/10/11,6,制备基因工程药物的一般程序,一、概 述,获得目的基因,组建重组质粒,构建基因工程菌（或细菌）,培养工程菌,除菌过滤,半成品检定,包装,2023/10/11,7,传统制药存在的问题,许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内源性活性物质（如激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类等人体活性多肽）以及某些疫苗，由于材料来源困难或者制造技术问题而无法研制出产品而付诸应用。从动物脏器中提取出来（比如动物脑垂体中的一些肽类激素，包括肾上腺皮质激素、催产素起引产或催产作用，胃肠道类激素缓激肽等），也因造价太高，或来源困难而供不应求。,一、概 述,2023/10/11,8,
4、传统制药存在的问题,由于免抗原等缘故（由于酶的相对分子量较大，对人体可能具有抗原性，因此动物酶如作为注射用药要经过大量的药理实验），使他们在使用上受到限制。在提取过程中难免有病毒感染，因此还可能会对病人造成严重后果。,一、概 述,2023/10/11,9,基因工程技术的特点,就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。,一、概 述,2023/10/11,10,基因工程技术的特点,可大量生
5、产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障；可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源,一、概 述,2023/10/11,11,二、目的基因的获得,从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。原核细胞不能直接克隆真核基因。,来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，是不能进行直接分离的，原因有二：,2023/10/11,12,二
6、、目的基因的获得,逆转录法,目的克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法：,DNA序列不含内含子,2023/10/11,13,二、目的基因的获得,1 mRNA的纯化,利用mRNA的3末端含有polyA的特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱下来，经过两次寡聚（dt）纤维素柱后，可得到较高纯度的mRNA。,2023/10/11,14,二、目的基因的获得,2 cDNA第一链的合成,一般mRNA都带有3-poly A，所以可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDN
7、A链的合成。一次好的逆转录可使寡聚dT选出的mRNA有5%30%被拷贝。,2023/10/11,15,二、目的基因的获得,3 cDNA第二链的合成,先用碱解或RHase酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。,2023/10/11,16,二、目的基因的获得,4 cDNA克隆,用于cDNA的克隆载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如gt10、gt10）等。根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。在DN
8、A克隆操作中应根据不同的需要选择适当的载体。,2023/10/11,17,二、目的基因的获得,5 将重组体导入宿主细胞,体外包装的重组体感染受态宿主细胞。,2023/10/11,18,二、目的基因的获得,6 cDNA文库的鉴定,cDNA文库是指细胞中全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总各。根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采取凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析法等方法进行进一步筛选和鉴定。,2023/10/11,19,二、目的基因的获得,7 目的cDNA克隆的分离和鉴定,从cDNA文库分离特异性cDNA克隆，主要采用下列两种方法：1 核酸探针杂交法
9、；2 免疫反应鉴定法。,2023/10/11,20,二、目的基因的获得,反转录-聚合酶链反应法,目的克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法：,1985年聚合酶链反应（PCR）创立后，人们将它与反转录方法结合起来得到一种新的合成cDNA的方法，即反转录-聚合酶链反应法。该方法是mRNA经反应转录合成cDNA第一链，不需要再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异性地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。,2023/10/11,21,二、目的基因的获得,化学法,目的克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法：,较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得,合
10、成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。,2023/10/11,22,二、目的基因的获得,人工化学合成基因的限制：A 不能合成太长的基因。最长50-60bp。只适用于克隆小分子肽的基因。B 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。C 费用太高。,2023/10/11,23,三、目的基因的表达,基因表达 是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因
11、高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。,2023/10/11,24,三、目的基因的表达,基因表达研究的主要问题：基因表达产量 表达产物的稳定性 产物的生物学活性 表达产物的分离纯化,2023/10/11,25,三、目的基因的表达,容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料 不致病、不产生内毒素 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态 容易进行代谢调控 容易进行DNA技术操作 产物的产量、产率高，且易提取纯化。,一、宿主细胞的选择,2023/10/11,26,三、目的基因的表达,原核细
12、胞真核细胞,一、宿主细胞的选择,大肠杆菌枯草芽孢杆菌链霉菌,酵母丝状真菌哺乳动物细胞,2023/10/11,27,外源基因在大肠杆菌中的表达,2023/10/11,28,外源基因在大肠杆菌中的表达,表达载体必须具备的条件,1.载体能够独立的复制2.具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克 隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基 因得以表达3.具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合 酶所识别4.具有很强的阻遏子，使启动子受到控制，只有 当诱导时才能进行转录,2023/10/11,29,外源基因在大肠杆菌中的表达,表达载体必须具备的条件,5.具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力 量转录
13、克隆的外源基因，而不转录无关的基因 同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定6.所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即 起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻 译。,2023/10/11,30,外源基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,大肠杆菌表达外源基因的优势：,全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,2023/10/11,31,外源基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,大肠杆菌表达外源基因的劣势：,表达不存在信号肽，故产品
14、多为胞内产物，提取困难 缺乏对真核生物蛋白的复性功能 缺乏对真核生物蛋白的修饰加工系统 易引起免疫反应 细胞周质内含有种类繁多的内毒素,2023/10/11,32,外源基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,大肠杆菌作为外源基因的表达宿主，遗传背景清楚，技术操作简便，培养条件简单，大规模发酵经济，因此备受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的高效表达体系，并常常作为高效表达研究的首选体系。,2023/10/11,33,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,启动子,终止子,转录,核糖体结合位点密码子质粒拷贝数,翻译,2023/10/
15、11,34,外源基因在大肠杆菌中的表达,启动子,2023/10/11,35,外源基因在大肠杆菌中的表达,启动子,Lac 表达系统,以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统转录调控机理,具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP 负调节因子lac1,2023/10/11,36,Lac 表达系统,正调节因子CAP,cAMP激活CAP，CAP-cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与-35、-10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。基因工程中使用的lac启动子均为抗
16、葡萄糖代谢阻遏的突变型，即Plac UV5,2023/10/11,37,Lac 表达系统,Lac UV5 突变体,Plac UV5 突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效地起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lac1 的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。,2023/10/11,38,Lac 表达系统,负调节因子 lac1,在无诱导情形下，lac1基因产物形成四具体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。,2023/10/11,39,Tac 表达系统,tac 启动子是由trp的-35 序列和lacUV5的-10 序列拼接 而成的杂合启动子,调
17、控模式与lacUV5相似，但mRNA 转录水平更高于trp 和lacUV5启动子（P tac=3 P trp=11P lac），因此在要求 较高基因表达水平的情况下，选用tac 启动子比用lacUV5 启动子更优越。,2023/10/11,40,Lac、tac启动子对宿主菌的要求,在普通大肠杆菌中，Lac1阻遏蛋白仅能满足细胞染色 体上lac操纵子转录调控的需要。,当多拷贝的的lacO随着带有 lacUV5、tac启动子的表达 质粒转化进入大肠杆菌后，Lacl阻遏蛋白与lacO的比例 显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的Lacl阻 遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，l
18、acUV5、tac 启动子有较高的本地转录。,2023/10/11,41,Lac、tac启动子对宿主菌的要求,为了使以Lac、Tac表达具有严紧调控外源基因转录的 能力，一种能产生过量的Lacl 阻遏蛋白的lacl 基因突变 体laclq被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacq，常被选用为 Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调 控，在使用高拷贝复制子的构建表达载体时，仍能观 察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacq基因以保证有较多的Lacl阻遏 蛋白产生。,2023/10/11,42,Lac、tac表达系统存在的问题,I
19、PTG 用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。,一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG,解决方法,lac 和tac启动子的转录受温度严紧调控 乳糖替代IPTG诱导lac 和tac 启动子的转录,2023/10/11,43,Lac、tac表达系统存在的问题,Lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控,把阻遏蛋白Lacl的温度敏感突变体lacl(ts)、lacq(ts)插入表达载体或 整合到染色体后，均能使lac 和 tac启动子的转录受到温度严紧调控 在较低温度（30）时抑制，在较高
20、温度（42）时开放。,用乳糖替代IPTG诱导 lac 和 tac 启动子的转录,乳糖在-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作 用这一过程涉及乳糖的转运和和转化，其效率受到多种因素的影 响和制约，因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存 在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代IPTG作为诱导剂 的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。,2023/10/11,44,外源基因在大肠杆菌中的表达,启动子,Trp 表达系统,以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统转录调控机理,色氨酸启动子Ptrp受色氨
21、酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录 呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），变可有效地解除阻遏作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因 工程中往往添加IAA诱导Ptrp 介导的目的基因表达。,2023/10/11,45,Trp 表达系统,2023/10/11,46,外源基因在大肠杆菌中的表达,启动子,PL 和 PR 表达系统,以噬菌体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达系统在野生型 噬菌体中，PL、PR启动子转录与否决定了 噬菌体进入了裂解循环还是溶源循环。,2023/10/11,47,PL 和 PR 表达系统,转录调控的机理,由噬菌体PE启动子控
22、制的cl基因的产物是PL、PR启动子转录的阻遏物。cl 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制 cl 基因产物的产生和消失是相当困难的。因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cl 857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。在较低温度下（30）时以活性形式存在 在较高温度（42）时失活脱落,2023/10/11,48,PL 和 PR 表达系统,宿主菌中没有cl基因产物，PL、PR启动子的高强度直接转录，带有PL或PR启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定,对宿主菌的要求,用溶源化噬菌体的大肠杆菌作PL、PR
23、启动子表达载体 的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已经溶源化cl 857(ts)噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。把 cl 857(ts)基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大,2023/10/11,49,PL 和 PR 表达系统存在的问题,由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或PR表达系统。,缺陷,在热脉冲诱导中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激 活，其中一些是蛋白质水解酶，有可能降解所表达的重 组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养 温度提高到42需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影 响
24、诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。,2023/10/11,50,T7表达系统,大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。,2023/10/11,51,T7表达系统,T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性激活 T7 噬菌体启动子的转录。T7 RNA 聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆 菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠 杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形 下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转 录体系，最终T7噬菌体启动子控制的基因
25、的转录达到很 高的水平。,2023/10/11,52,T7表达系统,转录调控的机理,T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录模式就决定了表达系统的调控方式。,化学诱导型温度诱导型双质粒系统,2023/10/11,53,T7表达系统,转录调控的机理,化学诱导型,噬菌体DE3 是噬菌体的衍生株，一段含有lacl、lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int 基因中用噬菌体DE3作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。,2023/10/11,54,T7表达系统,转录调控的机理,温度诱导型,PL启动子控制 T
26、7 RNA 聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录酶降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。,2023/10/11,55,T7表达系统存在的问题,T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。,解决办法之一,因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还 能与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7 溶菌酶基因都通过共转化质粒导入表达系统，它能 明显降低本底转录，但对诱导后目的的基因的表达水平无 明显影响。,202
27、3/10/11,56,其他表达系统,营养调控型,采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因phoA启动子或甘油3-磷酸转移系统ugp启动子构建表达载体。这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi 5mmol/L 时抑制，Pi1mmol/L 时激活），具有 较高的转录水平。,2023/10/11,57,其他表达系统,糖原调控型,采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mg1BAEC）mgl启动 或沙门氏菌阿拉伯糖基因araB启动构建表达载体。这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的 诱导物。其调控机理类似于Lac表达系统。,2023/10/11,58,其他表达系统,pH调控型,采用大肠杆菌赖氨酸
28、脱羧酶基因cadA 启动子构建表达载 体。cadA启动子受培养基中H+浓度，即pH值调控。（在 pH8时抑制，pH6时激活，pH=6 时转录活力最高）。该表达系统要求菌体发酵温度控制在2730之间才能使 目的基因得到稳定的表达。,2023/10/11,59,其他表达系统,溶氧调控型,采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 启动子，硝基还 原酶基因nirB启动子或透明颤菌血红蛋白基因 vgb 启动子 构建表达载体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子 fnr的作用位点。在富氧条件下转录被抑制，在贫氧或微生物条件下转录被 激活。,2023/10/11,60,其他表达系统,溶氧调控型,大肠杆菌 G
29、J100 有透明颤菌血红蛋白基因（vgb）启动子 控制下的T7 RNA 聚合酶基因表达质粒，vgb 基因的转录 是受环境溶氧浓度调控的，在贫氧条件下vgb 基因的启动 子被激活。因此，用大肠杆菌GJ100作为宿主时，表达系统调控方式 为贫氧诱导型，菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌 转速和通气量加以调节，与其他调控模式相比更适合于产 业化生产过程。,2023/10/11,61,其他表达系统,生物素调控型,用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体，而菌 体生长过程中生物素会不断消耗，当浓度到达2ng/ml以下 时启动子被激活。能够在没有外界的物理，化学信号的介入条件下自动诱导 表达目的基因
30、时这类表达载体的特点，其缺陷是不容易精 确控制自动诱导的时刻。,2023/10/11,62,终止子,强化转录终止的必要性,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物，过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增 加，外源基因本身的转录效率下降。如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可 能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳
31、定性。过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程无谓的能量 消耗。更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而 大大降低外源基因编码产物的翻译效率。,2023/10/11,63,终止子,强终止子的选择与使用,目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的T。,对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体 终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。,2023/10/11,64,核糖体结合位点,核糖体结合位点,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率
32、密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA 翻译的起始效率主要由其5端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）,2023/10/11,65,2023/10/11,66,核糖体结合位点,核糖体结合位点,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5UAAGG AGG 3即Shine-Dalgarno（SD）序列，他通过识别大肠杆 菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3AUUCCUCC 5 并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻 译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大
33、部分基因以AUG作为阅读 框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译 起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区5端若干密码子的碱基序列,2023/10/11,67,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列的影响,一般来说mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG）序列与16S rRNA 的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。,2023/10/11,
34、68,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列与起始密码子之间的序列影响,SD序列下游碱基若为AAAA或UUUU，翻译效力最高；而CCCC或GGGG 的翻译效率则分别最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。对于大肠杆菌-半乳糖苷酶的mRNA 而言，在这个位置 上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或 AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。,核糖体结合位点,2023/10/11,69,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列与起始密码子之间的距离的影响,SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子A
35、UG正好处于核糖 体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均导致翻译起始 效率不同程度的降低。,核糖体结合位点,2023/10/11,70,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,起始密码子及其后续若干密码子的影响,大肠杆菌中的起始tRNA 分子可以同时识别AUG、GUG 和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关 重要，至少这一序列不能与mRNA 的5端非编码区形成 茎环结构，否则便会严重干扰m
36、RNA在核糖体上的准确 定位。目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列 和间隔是最佳的。,核糖体结合位点,2023/10/11,71,密码子,生物体对密码子的偏爱性,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：,生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势,2023/10/11,72,密码子偏爱性对外源基因表达的影响
37、,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。,一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因,密码子,2023/10/11,73,质粒拷贝数,质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响,目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细菌中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致
38、重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道,2023/10/11,74,外源基因在大肠杆菌中的表达,蛋白质的合成是在细胞之中进行的,目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是：,表达质粒的构建比较简单；能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞 总蛋白的20%40%。,目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有两种：,在细胞内表达为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于本身 的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分泌 到周质空间，或分泌到培养
39、液中。,2023/10/11,75,外源基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌基因工程菌的构建策略,包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷性表达系统的构建,2023/10/11,76,包涵体性异源蛋白的表达,包涵体及其性质,在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和
40、生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠工程杆菌大量合成非天然的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白质分子,2023/10/11,77,以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点,包涵体表达形式的优点在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白质水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白,包涵体
41、性异源蛋白的表达,2023/10/11,78,以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点,包涵体表达形式的缺点 以包涵形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变性复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白的成功率相当低，一般不超过30%,包涵体性异源蛋白的表达,2023/10/11,79,包涵体的变性与复性操作,包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错
42、配的二硫键和次级键。在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复兴途径中。,能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：清 洗 剂 SDS、正十二醇肌氨酸、廉价，但影响复性和纯化促 溶 剂 盐酸胍，尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极 端 pH 廉价、但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应,包涵体性异源蛋白的表达,2023/10/11,80,包涵体的变性与复性操作,包涵体的复性与重折叠（refolding）,包涵体的复性与重折叠的主要任务 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质
43、复性,包涵体性异源蛋白的表达,2023/10/11,81,这是因为大肠杆菌细胞质微环境的氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成，而且缺少一种形成二硫键所必须的体系。一些需要通过二硫键的形成来维持其构象的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠。解决这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白还原酶基因trxB缺陷株作为宿主菌表达目标蛋白。研究表明trxB缺陷株细胞质中能够形成二硫键。这一菌株对于表达结构复杂的蛋白质而言是一个相当重要的工具。,包涵体性异源蛋白的表达,2023/10/11,82,分泌型异源蛋白的表达,在细胞内表现为可溶性的蛋白质,目标蛋白以可溶性蛋白质形式表达虽然可以避免包涵体复性
44、带来的问题，但是也有一定的缺陷，主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的，甚至没有半胱氨酸残基。富含半胱氨酸残基，需要形成二硫键的蛋白质大部分被转运到细胞的其他部位。,2023/10/11,83,在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质,在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质需要起始密码，通常为编码甲硫氨酸的 ATG。在多数情况下，N端附加的甲硫氨酸对蛋白质的性质没有特别的影响，但是也有附加的甲硫氨酸严重影响蛋白质生物活力的报道。另外，附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质。从制备用于医疗目的的蛋白质的角度来看，这是一个需要引起重视的问题。,2023/
45、10/11,84,去除附加的甲硫氨酸有两种方法：,在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。在分离纯化后在体外用外肽酶处理。但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨基酸残基类型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。,2023/10/11,85,目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达,与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。金黄色葡萄糖球菌蛋白G、A和衍生物7，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糠结合蛋白，His-tag
46、等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。,2023/10/11,86,目标蛋白在周质空间中表达,目标蛋白在周质空间中表达的优点,大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为100种，只占 菌体总蛋白数量的4%。蛋白质水解酶的含量与在细胞中 相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分 离纯化和减少蛋白水解酶的降解。目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切 除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的产生。周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好 折叠，维持正确的构象。,2023/10/11,87,目标蛋白外泌表达,把所表达的目标蛋白外泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解，也有利于分离纯化。目前成功的例子主要是采用以下方案：与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达 与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达 改变培养基的成分 归纳现有的研究结果显示这些方法仅对外泌分子量较小的蛋白质有效，而且外泌效率一般都比较低。,
