基因工程基础.ppt

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1、第10章 基因工程基础,第一节 基因工程概述第二节 目的基因的获得第三节 分子克隆中常用的载体第四节 分子克隆中常用的工具酶第五节 目的基因和载体连接、转化、筛选第六节 基因工程和医药,DNA克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合.获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning),即无性繁殖.技术水平:DNA克隆:分子克隆(molecular clone)细胞克隆个体克隆(动物或植物),第一节 基因工程概述,DNA克隆:应用酶学的方法,在体外将各种来源的DNA(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的分子复制子(replicon)

2、,继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA(rebinant DNA).,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,基因工程(genetic engineering):实现基因克隆所用的方法及相关的工作,又称重组DNA工艺学.目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质),第二节 目的基因的获得,一 目的基因的获得:化学合成聚合酶链式反应(PCR)方法扩增建立基因组DNA文库构建cDNA文库,化学合成法:要求:1)已知目的基因的序列或其产物 的氨基酸序列 2)片段不宜太长 工

3、具:自动化DNA合成仪 应用:1)合成PCR引物 2)寡核苷酸探针 3)人工接头序列及较小的基因,*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,聚合酶链式反应(PCR)方法扩增,1985年美国科学家Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术PCR是应用最广的分子生物学技术之一,可用来快速在体外扩增DNA,PCR技术在临床检验和分子生物学中的应用十分广泛.PCR技术就是在体外的离心管中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术,即体外进行DNA复制.,需要的物质:模板DNA,引物,dNTP(Mg2+),Ta

4、qDNA聚合酶4种反应混合物经历变性、退火、延伸三步 94,热变性,双链解开 55,冷却退火,引物与模板的单链DNA 的特定互补部位相配对和结合 72,TaqDNA聚合酶作用下,新链延伸,形成互补DNA双链 如此30个循环可获得230个基因片段,聚合酶链反应原理,Taq DNA聚合酶(Taq DNA pol,Taq pol)1969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真菌,cetus公司首次分离纯化了该酶,分子量94KD,该酶特点:最适反应温度是75-80,能抵抗链分离所需要的高温(94-95)的反复处理.,建立基因组DNA文库,基因组DNA文库:分离供体细胞中的染色体DNA,酶切后,将这些染色

5、体DNA片段与某种载体相接,而后转入大肠杆菌,建立包含有供体染色体DNA片段的克隆株,特点:克隆株群体提供全套遗传信息,即完整的基因 组DNA,构建基因组文库过程:分离纯化基因组DNA制备全部基因组的DNA片段 机械断裂法(超声波或高速搅拌)断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工,少用 限制性内切酶降解(鸟枪法)(常用Sau3A)断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端,可以直接与处理过的载体连接DNA片断与载体的连接 常用载体:噬菌体转化细菌 1个克隆含有基因组的某个片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和.,构建cDNA文库,cDNA文库:以mRNA

6、为模板在反转录酶的作用下将形 成的互补DNA(cDNA)建立基因文库.特点:无内含子,长度比基因组基因小,操作简单mRNA比基因组中基因少,筛选基因工作量小mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板.可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同不能研究基因组的结构功能,构建cDNA文库过程:1)制备mRNA.先提取总RNA,再分离mRNA.通过oligo(dT)纤维素分离mRNA,2)第一股 cDNA合成 以Oligo(dT)为引物:从模板3末端开始,沿模板35方向合成随机引物:以68个核苷酸为随机引物,从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链

7、3)第二股cDNA的合成 自身引导法 外加引物合成法,4)cDNA与载体连接和导入宿主细胞,第三节 分子克隆中常用的载体,载体：为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达所采用的一些DNA分子.基本特征:能自我复制、有多克隆位点、有选择标记常用载体有3大类:1.质粒 2.噬菌体 3.病毒,根据使用目的分为：克隆载体：使插入的外源DNA序列扩增表达载体：使插入的外源DNA序列转录翻译成多肽链,理想的质粒载体,应具备以下几个条件(1)能自主复制,即本身是复制子(2)具有一种或多种限制酶的单一切割位点,并在此位点中插入外源基因片段,不影响本身的复制功能(3)在基因组中有1-2个筛选标记,为寄主细胞提供易于

8、检测的表型特征,(4)分子量要小,多拷贝,易于操作.,一 质粒载体,1.质粒的基本特性本质是细菌染色体以外的遗传物质,是一种简单的,能自主复制的环状DNA分子.命名:前一个小写p代表质粒,后两个大写英文字母代表发现者或实验室,数字代表编号,如pBR322,质粒的复制类型:严紧型:低拷贝 1-3个拷贝/菌 松弛型:高拷贝 10-60个拷贝/菌不相容性:在同一细胞中,同类质粒不能并存的现象.pUC18 pUC19分配功能:质粒复制后,随细胞分裂的进行,质粒分配到子细胞中,2.质粒的分离纯化方法,氯化铯-溴乙锭密度梯度超速离心分离法Triton和PEG化学提取法 煮沸裂解菌体,异丙醇沉淀质粒DNA碱

9、变性法抽提质粒DNA试剂盒法,1、接大肠杆菌于4ml LB培养基2、37振荡培养过夜3、取1.5ml菌液于Ep管,5000rpm离心3min,弃上清4、加0.lml溶液I(1葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1 SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min7、10000rpm离心15min,取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇,混匀后于静置10min9、再以1000

10、0rpm离心5min,弃上清10、用70乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中,3.大肠杆菌质粒载体,1)pSC101质粒载体第一个克隆真核基因的载体(非洲爪蟾卵母细胞rDNA),Ampr,ORI,Tetr,2)pBR322质粒:一种克隆质粒,ORI:复制起始点,保证高拷贝自我复制.,结构:,Ampr,Tetr:,两个抗性基因用于筛选阳性克隆.,Pst I,BamH I:,两个单酶切位点用于插入目的基因,3)多功能质粒-pUC质粒,pUC质粒由pBR322改建成的,带有LacZ基因.LacZ上有多克隆位点,插入外源基因后在X-gal平板上使原先的蓝

11、斑变成白斑.,4)pET系统(Novagen公司),5.酵母表达常用载体,6.哺乳动物细胞常用表达载体,腺病毒载体系统,BACK,常用的工具酶（tool enzymes）有：1.限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease)2.DNA连接酶（DNA ligase)3.逆转录酶(reverse transcriptase)6.末端转移酶(terminal transferase)以1.和2.最为常用.工具酶现已商品化,第四节 分子克隆中常用的工具酶,一 限制性核酸内切酶定义:一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DN

12、A双链结构的核酸内切酶.限制性内切酶的发现 Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不被外来噬菌体所感染,而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰(甲基化)而得以保护,这种现象叫做限制修饰.,第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序.,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到第一个限制性内切核酸酶Hind I,分类:型:识别和切割位点不固定,随机型:核酸内切酶活性和

13、甲基化活性不分开型:能特异在识别位点处切割DNA.核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的.最常用！,型限制性核酸内切酶基本特性:特异的识别48个核苷酸组成的识别序列,识别序列呈回文结构:两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5,EcoR,1.产生5突出粘性末端(sticky end),EcoR I,经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型:,2.产生3突出粘性末端,3.产生平末端(blunt end),Alu I,影响限制性内切酶活性的因素,DNA的纯度,增加酶量、扩大体积、延长时间DNA的甲基化,选用失去甲基化功能的菌株温度,一般37,还有25.30.

14、60等分子结构,超螺旋,线性,识别序列两侧限制酶的缓冲液,Mg2+,Tris-Cl,DTT,BSA,NaCl,KCl等 星号活性(star activity)EcoR切 GAATTC EcoR*切 pupuATpypy 或AATT,限制性内切酶用途:,基因重组过程中切割DNA以获取目的基 因片段,切割载体形成切口,使目的基因能插入载体中.,2.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphysms,RFLP)分析:遗传病的诊断,法医 DNA指纹分析等.,3.构建DNA的物理图谱,基因定位,DNA的 同源性分析等等.,二 DNA连接酶,DNA连接

15、酶(Ligase)是一种能够催化在双链DNA链的3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键的酶,可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复,不能连接单链DNA或裂口常用的是T4 DNA连接酶：来源噬菌体T4感染Ecoli,三 逆转录酶以RNA为模板,逆转录成cDNA第一链,又称依赖RNA的DNA聚合酶.(AMV最常用)聚合酶活性:RNA或DNA为模板 3外切酶活性:能降解DNA-RNA杂合链中的RNA应用:1.RT-PCR 使mRNA逆转录成cDNA 2.制备探针商品化逆转录酶有两种：AMV(禽成髓细胞瘤)Mc-MLV(鼠白血病病毒).,四 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal transferase,T

16、TE)可催化DNA片段上3-OH端加接脱氧核糖核苷酸(不需模板,但底物至少要3个bp,需Mg2+)常用于同种碱基多聚体接尾反应核素标记DNA片段的3端,第五节 目的基因和载体连接、转化、筛选,一 外源基因与载体的连接粘性末端连接方式:(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,2.平端连接限制性内切酶切割产生的平端，直接连接效率低,导入大肠杆菌1.原生质体转化法2.氯化钙转化法3.电击法,导入哺乳动物细胞1.显微注射法2.电穿孔法3.DNA-磷酸钙共沉淀4

17、.DEAE-葡聚糖转染法5.病毒感染法6.脂质体介导法7.细胞融合法8.原生质体融合法,二 重组DNA导入受体菌,转化就是以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞(感受态)的过程.感受态细胞是指细胞处于容易接受外源DNA的状态.常用CaCl2法制备,过程:接种细菌振荡过夜以约1:100的接种量接入新的20ml LB中培养至OD6000.3-0.4,离心(5K,5)收集菌体加入预冷CaCl2(10ml 100mM)冰浴20离心收集菌体加入100ul100mM预冷CaCl2混匀加甘油保存-80度,转化方法:原生质体转化法 除去细胞壁后加外源DNA,经吸收恢复再生培养,如枯草杆菌 化学转化法(CaC

18、l2法)冰浴30min42 90s冰浴2min加37预热LB培养45min,取50-200ul/皿涂布,37倒置培养过夜,观察细菌生长情况电穿孔法原理:利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,脉冲过后,微孔复原.操作更简单,转化效率高,不仅无需制备感 受态细胞,而且适用于任何菌株.,三.转化子的筛选与鉴定,转化子,重组子,阳性克隆:都指带有重组质粒(含目的基因)的菌株,利用遗传标志的表型特征筛选,2.-半乳糖苷酶(LacZ)基因失活筛选法,非重组质粒:不含有插入的DNA 蓝色菌落重组质粒:含有插入的DNA:白色菌落,非重组质粒,重组质粒,(二)根据重组子的结构特

19、征筛选1)重组子大小鉴别筛选菌落提取质粒电泳2)酶切鉴定菌落提取质粒双酶切电泳3)PCR筛选法 能与插入基因片断两端互补的特异引物,以少量抽提的重组子DNA为模板,进行PCR分析 4)测序,原位杂交,一 疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质,而认识疾病的分子机制.,第六节 基因工程和医药,二 生物制药,基因工程可大量生产天然稀有存在的 重要的肽或蛋白质.,基因工程可根据人的意愿设计生产出天然不存在的有重要生物活性的肽或蛋白质.,人类基因组计划及后基因组计划的成果 将为基因工程提供难于估量的广阔发展空间.,重组DNA医药产品,三 基因诊断,基因诊断(genetic diagnosi

20、s)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理,在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变.发现并获得某种疾病的特异性基因 是基因诊断的基础.,四 基因治疗(gene therapy),基因治疗的策略,1.基因置换:以正常基因替换缺陷基因.,一切通过基因水平的操作而达到,治疗疾病目的疗法.,2.基因补偿:导入正常基因,补偿缺陷基 因的功能.,3.基因失活:用反义核酸封闭有害基因 的表达.,定义:,1.目的基因的表达水平太低或难于精确控制.,2.目的基因的转移和表达缺乏足够的 靶向性.,3.对基因表达调控、基因表达产物的功能的认识还很少.,目前基因治疗面临的问题,补充：多利诞生

21、的过程1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞,分离基因备用.2.取出第二只母羊未受精的卵细胞,取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因(“掉包”),放电激活该卵细胞,使之象正常受精卵一样进行细胞分裂,直至一定阶段,胚胎成熟.3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育,妊娠(同正常一样),最后产下多利.一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了,此克隆非彼克隆 胚胎细胞克隆 体 细 胞 克 隆供体细胞 胚胎细胞(核)体细胞(核)受体细胞 去核未受精的卵细胞 去核未受精的卵细胞发育场所 母体宫腔 母体宫腔关键区别 克隆的是子代(多生了一个)复制的是自己(复制了一个),克隆是一把双刃剑,试想,有了克隆技术,

22、有人在你毫不知晓的情况下复制一个“你”去犯罪,怎么办？试想,有了克隆技术,一些极权的政治野心家一下子克隆出好几个战争狂人希特勒、墨索里尼,怎么办？还有,有了克隆技术,世界上同时生活着多个你、我、父母、兄弟、姐妹,按现行的社会伦理道德很难为其“名份”定位,又该怎么办？因此说克隆对人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战,平添一系列是我非我、是父非父、是妻非妻、是子非子之类的麻烦事,绝非危言耸听.从社会伦理角度看,用克隆技术培育出的人,有其特定的生理性状,这对人类的自然发展和人种的自然构成无疑会产生极大的影响.,从家庭伦理角度看,将克隆技术用于人体繁殖,会加剧家庭多元化倾向,还会从根本上改变人的亲系关系,确定人类亲系关系的标准也将发生改变.从性伦理角度看,它完全改变了人类自然的基于性爱的生育方式,使人口的生产与性爱分离,从而破坏男女之间基于性受而获得后代的情感,并由此改变人类的基本性伦理关系.从遗传学上看,人本来是由两性细胞结合而产生的,这种结合有利于人种进化,而克隆使人的遗传基因成为单一的,势必导致人种退化.从哲学上看,克隆还会使人们正常的生与死的概念发生动摇.,Transgenic tobacco plant with gene for firefly luciferase,BACK,