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1、基因工程实验,生物化学资料网,实验目录,实验一 实验计划表实验二 染色体DNA的提取实验三 PCR扩增实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接实验五 感受态细胞的制备实验六 重组质粒的转化实验七 质粒的提取实验八 重组质粒的酶切鉴定,实验一 实验计划表,一、实验目的,、了解本学期整体的实验流程及安排。、熟练使用微量移液器。、学习制备琼脂糖凝胶。,生物化学资料网,基因工程（Gene Engineering）又称重组技术，把不同生物的与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。,二、实验原理,生物化学资料网,凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子
2、、手套琼脂糖、1TBE、加样缓冲液,三、实验用具及试剂,目的基因的获取基因组总提取凝胶电泳检测扩增目的基因 产物的电泳检测产物纯化获得目的基因,四、实验操作,1.本学期实验计划,生物化学资料网,重组、转化与pMD18-T连接DH5a感受态细胞制备 转化、平板涂布、培养筛选与鉴定抗生素抗性筛选挑单菌落培养提取质粒质粒酶切、电泳检测,2.微量移液器的使用,将微量移液器按钮轻轻压在第一挡垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦
3、过平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过然后按吸头弹射器除去吸头,使用操作,生物化学资料网,使用注意事项,未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。不要横放带有残留液体吸头的移液器不要用大量程的移液器移取小体积样品微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保持弹性。为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。,生物化学资料网,3.琼脂糖凝胶制作,选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。量取25ml 1TBE溶液
4、放入锥形瓶或烧杯中称量0.25g 琼脂糖，倒入锥形瓶中将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻底融化锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可,掌握酚氯仿法提取的原理和操作。,一、实验目的,实验二基因组总提取,生物的大部分或几乎全部都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去
5、除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。,二、实验原理,消化缓冲液:TE、EDTA、NaCl、SDS、蛋白酶KTris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇,三、实验用具与试剂,微量移液器、高速离心机、1.5ml管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱,、切取组织，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55水浴过夜，获得组织消化液。、取出消化组织液，5000rpm，min，取上清液于新离心管。、加等体积ris-平衡酚，轻轻混匀min。4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心管
6、。、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀min。、同。、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀min。、同。,四、实验步骤,、加1/10体积3mol/LNaAc，及.倍体积预冷（）无水乙醇，混匀。沉淀min。、12000rpm，15min，弃上清。、加70%乙醇1ml，混匀。、同。、管放置于烘箱中烘干。、加ul TE或ddH2O溶解。、琼脂糖凝胶电泳检测。,提取染色体的基本原理是什么？操作中应该注意什么？,五、思考题,、学习扩增的基本原理。、掌握技术的常规操作。、了解扩增的参数设计。,一、实验目的,实验三扩增,、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PC
7、R)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异片段的过程。、反应体系引物、dNTP、Mg、模板、Taq DNA聚合酶，Buffer。,二、实验原理,、循环参数 9 5min 9 30s 5 30s 72 30s goto times 72 10min,Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液,三、实验用具与试剂,旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统,、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul
8、反应体系。dd water 20.5ul 10PCR buffer（不含MgCl2）3ul 25mM MgCl2 2ul 10mmol/L dNTP 1ul 10mol/L Primer 1 1ul 10mol/L primer 2 1ul 模板 1ulTaq酶 0.5ul 总体积 30ul,四、实验步骤,、在离心机中混匀。、管放入仪中，按照原理中的条件设置程序，进行反应。、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。,五、思考题,PCR中产生非特异性条带的原因可能有哪些？,实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接,一、实验目的,1.学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方
9、法。2.掌握DNA体外连接的方法。,二、实验原理,DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关DNA分子大小DNA分子构象琼脂糖凝胶浓度电泳所用电压电泳缓冲液,生物化学资料网,2.利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。3.Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65 水浴锅PCR产物，1TBE，加样缓冲液，Ta
10、kaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker,生物化学资料网,1.2%琼脂糖凝胶电泳2.在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量3.加入5个凝胶体积量的DR-Buffer 4.混匀 65加热融化凝胶块5.加入DR-Buffer量的1/2 体积的DR-Buffer,当目的片段小于400bp再加入终浓度为20%的异丙醇6.将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm,1min 弃滤液7.加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液8.加入700ul RinseB 12000rp
11、m 30s弃滤液9.同8,四、实验步骤,10.将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测11.链接反应（冰上操作）在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂：纯化的目的DNA片段 4.5ulVector 0.5ul连接液 5ul 混匀 16连接过夜,五、思考题,为什么连接反应的温度要定在16度？,生物化学资料网,实验五 感受态细胞的制备,掌握感受态细胞的制备方法2.学习和理解影响细胞感受态的因素,一、实验目的,生物化学资料网,感受态
12、是指受体（或者宿主）细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是有受体菌的遗传性所决定的。转化过程中所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，既不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。用Cacl2处理受体细胞，使细胞的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。,二、实验原理,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,培养皿，离心管，冷冻高速离心机，超低温冰箱，摇床，锥形瓶Cacl2，LB Amp-液体培养基，LB Amp-固体培养基，DH5甘油菌,1.先从保存菌种DH52(-70),划线培16h(37)2.从平板中挑取一个单菌落移到4ml，LB Amp-培养基
13、中，37摇荡过夜180250rpm3.按1%的接种量将过夜培养的菌转接于50ml LB Amp-的培养基中，37，250rpm（2h2.5h）4.当培养菌生长至OD600达0.50.6时（约22.5h），将培养菌取出，在无菌条件下将细菌转移至50ml无菌聚乙烯离心管中，冰浴10min，以使培养液冷至0,四、实验步骤,5.4，5000rpm/min,7min6.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬于4，5000rpm/min，5min7.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬冰上放置30min，于4，5000rpm/min，5min8.用2ml冰冷Cacl2溶液重悬各管细胞，然后按每管
14、100ul的量分装于预冷的0.5ml EP管中存于-70,生物化学资料网,五、思考题,如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？,生物化学资料网,实验六 重组质粒的转化,一、实验目的,掌握重组质粒的转化方法,生物化学资料网,二、实验原理,1.转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。2.化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,水浴锅，培
15、养箱，枪头，冰盒，超净台，微量加样器，制冰机，牙签DH5感受态细胞，连接产物，LB Amp-液体培养基，LB Amp+液体培养基，LB Amp+培养基平板,1.5ul连接液加100ul感受态细胞（-70取出），置冰上，加后轻轻旋动2.冰上静置30min3.42水浴90s热休克，冰上3min4.加10ul LB（Amp-）至菌液，混匀（颠倒）5.37烘箱30min6.37，摇床 30min 180rpm7.涂平板 100ul/板，37培养1216h8.挑克隆 挑取菌落接入5ml LB Amp+液体培养基中，37 振荡过夜,四、实验步骤,生物化学资料网,五、思考题,当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂
16、布在含有Amp的LB培养基平板前，为什么要在LB培养基中培养1h?,生物化学资料网,实验七 质粒的提取,1.学习质粒DNA提取的基本原理2.掌握质粒最常用提取方法,一、实验目的,生物化学资料网,二、实验原理,细菌质粒DNA的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量较小、易于复性的特点进行的，碱法是常用的提取方法。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性，从而分离质粒DNA。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,高速离心机、微量移液器、枪头、凝胶电泳系统，凝胶紫外成像系统，EP管EB，加样缓冲液，阳性克隆的培养
17、液，质粒提取试剂盒,生物化学资料网,四、实验操作,1.取14ml过夜培养的阳性克隆菌液，12000rpm离心2min,弃上清2.用250ul的solution(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀3.加入250ul的solution轻轻上下翻转混合56次使菌体充分裂解，形成透明溶液4.加入400ul的4 预冷的solution，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块，室温静置2min,生物化学资料网,5.室温12000rpm，10min，取上清6.将试剂盒中的Spin column安置于collection Tube上7.将操作6中的上清液转移至Spin column中12000rpm，1m
18、in，弃滤液8.将500ul的RinseA加入Spin column中，12000rpm，30s，弃滤液9.加700ul的RinseB加入Spin column中，12000rpm，30s，弃滤液10.同9,生物化学资料网,11.将Spin column安置于新的1.5ml离心管上,在Spin column膜中央处加入60ul灭菌或Elution Buffer,室温静置1min12.12000rpm，1min洗脱DNA13.凝胶电泳检测提取效果，并以空载体做对照，从质粒大小上初步判断是否有外源基因进入载体,生物化学资料网,五、思考题,在碱法提取质粒DNA操作过程中应该注意哪些问题？,生物化学资
19、料网,实验八 重组质粒的酶切鉴定,1.学习和掌握限制性内切酶的特性2.了解重组质粒的鉴定方法，重点掌握重组质粒的酶切鉴定方法,一、实验目的,生物化学资料网,二、实验原理,1.限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定,生物化学资料网,2.影响核酸限制性内切酶活性的因素DNA的纯度；DNA的甲基化程度；酶切消化反应的温度；DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类；缓冲液的 pH值。,生物化学资料网,
20、三、实验用品及试剂,恒温水浴锅、微量加样器、枪头、凝胶电泳系统、凝胶成像系统酶Hind III 和 BamH I 核酸内切酶（Takara），Hind III和 BamH I酶解缓冲液(10通用 buffer)，琼脂糖，pMD18-T质粒，加样缓冲液,生物化学资料网,四、实验步骤,对初步确定有外源基因进入的质粒用限制性内切酶进行切割，进行进一步的鉴定 重组质粒DNA 10ul ddH2O 7ul 10通用缓冲液 2ul BamH I（10U/ul）0.5ul Hind III（10U/ul）0.5ul 总体积 20ul,2.37 保温0.5-1h,3.利用空载体与目的基因片段为对照，对酶切后的片段进行比对，从酶切后的片段的数目及大小上进行确认,五、思考题,除了酶切鉴定重组质粒外，还可以选用何种方法鉴定？,
