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1、基因工程法生产乙肝疫苗,主讲人：张俊班级:生物工程（1）班学号：201230141,主讲内容,乙肝疫苗研制的发展目的基因的获取DNA的重组基因的克隆目的基因克隆的筛选目的基因克隆的鉴定基因的表达综述,乙肝疫苗研制的发展,国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代血源性乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。,目的基因的获取,获得乙肝疫苗目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合
2、成。,DNA的重组,将乙肝疫苗的DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。,DNA的克隆,即将乙肝疫苗重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化、转染、转导。转染是以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落。转染是以噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑。转导是噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。,目的基
3、因克隆的筛选,即从大量携带有乙肝疫苗的重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，
4、还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。,目的基因克隆鉴定,对于乙肝疫苗的重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。,基因的表达,这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物
5、(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。最后，利用发酵工程培养重组与乙肝疫苗的工程菌,综述,综上所述，用基因工程法生产乙肝疫苗要先经过乙肝疫苗目的基因的获取、DNA的重组基因的克隆、目的基因克隆的筛选、目的基因克隆的鉴定、基因的表达。最后还需通过培养工程菌、乙肝病毒表面抗原的分离纯化、产品多项性质的初步检测、成品化处理（如添加佐剂、抗生素、除菌）、成品检测鉴定、包装几个步骤。对产品多项性质的检测对于保证疫苗的安全性尤其重要。,
