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1、基因工程的操作,1、掌握基因操作的工具2、掌握基因操作的基本步骤3、了解获取目的基因的方法，掌握PCR技术与细胞内DNA分子复制的异同4、掌握基因操作的工具在构建基因表达载体过程中的重要意义5、掌握农杆菌转化法的过程，了解其它转基因的方法6、掌握目的基因检测的方法,学习目标,基因工程的操作步骤,目的基因的检测与鉴定,获取目的基因,构建基因表达载体,将目的基因导入受体细胞,第一步：获取目的基因,从基因文库中获取目的基因,基因文库包括基因组文库和cDNA文库,工具：限制酶，DNA连接酶,人工合成目的基因,条件是：,基因比较小，且核苷酸序列已知,方法：,1、从蛋白质合成,2、反转录法,3、PCR法,
2、第二步：基因表达载体的构建：,它们所处的位置和有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA聚合酶结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,标记基因,第三步：将目的基因导入受体细胞（又称为转化）,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,个体水平的鉴定,第四步：目的基因的检测与鉴定,关于限制酶的问题,一般来说，不同的限制酶有不同的识别序
3、列，有不同的切点位置，切出不同的黏性末端，但也有两种特殊情况：,1.不同的限制酶有不同的识别序列，但可以切出相同的黏性末端，如以下两种酶处理得到黏性末端均为AATT：,酶I,识别序列,GAATTCCTTAAG,酶II,AAAATTTTTTTTAAAA,两种酶经常用于同一个基因工程中,限制酶的选择使用,例题：基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶的识别序列和切点是GGATCC，限制酶的识别序列和切点是GATC。根据下图示判断下列操作正确的是,A目的基因和质粒均用限制酶切割B目的基因和质粒均用限制酶切割C质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割D质粒用限制酶切割
4、，目的基因用限制酶切割,限制酶的选择使用,变式训练1,抗四环素基因,EcoB,BamH,HinD,BamH,应选择哪种限制酶？,HinD,限制酶的选择使用,变式训练2,抗四环素基因,EcoB,HinD,BamH,抗青霉素基因,关于限制酶的问题,2.不同的限制酶有相同的识别序列，但可以切出不同的黏性末端，如：,酶I,识别序列,GGAATTCCCCTTAAGG,酶II,GGAATTCCCCTTAAGG,黏性末端,GAATTC,AATT,这两种酶不会在同一个基因工程中采用,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TD
5、NA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色体DNA,新性状,农杆菌,整合到染色体上,转移至受体细胞,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,常用于单子叶植物的转化方法,（2）基因枪法微弹轰击法,特点：成本高,适用于单子叶植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后
6、，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,早期胚胎,新性状动物,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取受精卵 显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,比较目的基因导入不同细胞的
7、方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca2+处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,.用含目的基因的DNA片段用放射性 同位素等作标记,以此做探针,.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,原理:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交,方法:用上述探针和转基因生物的mRNA
8、杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,PCR技术,原理：前提：原料：优点 过程：,PCR扩增仪,DNA复制,已知目的基因的一段核苷酸序列,：以_方式扩增，在短时间内大量扩增目的基因,指数,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子,变性,复性,延伸,关于PCR技术中的原料和能量,问题：PCR技术也是合成DNA分子的过程，属于合成反应，是消耗能量的，但图18中未提到能量。,图18分析：PCR的原料是dCTP、dGTP、dATP、dTTP。这四种物质并不是必修二中我们熟悉的四种游离的脱氧核苷酸，而是脱氧核苷酸连接上了两个磷酸，和ATP一样，是高能化合物
9、，在PCR过程中是可以提供能量的。,试题中，若指出原料是dCTP、dGTP、dATP、dTTP，则条件中不再另写能量，若原料是四种游离的脱氧核苷酸，则另外还需要ATP提供能量。,PCR技术和DNA分子复制比较,?,1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？,2（2n-1）(n为循环次数),（24-1）2=30,4.下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A.B.C.D.,3在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库
10、法 D、聚合酶链反应,5.加热至95摄氏度的目的是使DNA中的 断裂，这一过程在细胞内是通过 解旋酶 的作用来完成的。6.当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料，遵循的原则是。7.Taq酶的特点是（）A.耐强酸 B.耐强碱 C.耐高温 D.最适温度37摄氏度8.请指出PCR技术与DNA复制过程的区别,9.在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸
11、DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温A BC D,D,10.在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个,B,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,直接分离法,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(鸟枪法),多用于原核生物,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷
12、酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,人工合成法：,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,基因组文库的构建,1.构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA,2.目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做
13、基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA文库的构建-逆转录法：,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码系列。即不含非编码区和内含子,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,培养,培养,培养,导入,含目的基因
14、的重组质粒导入大肠杆菌,含有氨苄青霉素 的完全培养基,含有四环素的完全培养基,两种培养基均不能生长大肠杆菌,Ca2+处理细胞形成感受态细胞,检测,（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）,只有氨苄青霉素抗性基因质粒,只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌,不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌,完全培养基,导入,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,存
15、活,导入,接种培养,接种培养,接种培养,接种培养,含有四环素的完全培养基,完全培养基,大肠杆菌不含抗四环素基因,证明：,不存活,含有四环素的完全培养基,证明：,大肠杆菌含抗四环素基因,证明：,大肠杆菌的受体细胞含有目的基因,四环素抗性基因,四环素抗性基因,完全培养基,存活,如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？,5.目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A BC D,6.（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,D,7.下列关于基因表达载体的叙述不正确
16、的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪、脱分化、再分化、耐盐基因、一定浓度的盐水浇灌,
